pH試差法測定藍(lán)靛果花色苷及大孔樹脂純化的研究

劉敬華，王振宇，2＊

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090）

花色苷（anthocyanin）是由花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的類黃酮化合物，其母核是3，5，7－三羥基－2－苯基苯并吡喃陽離子，是植物體中廣泛存在的水溶性天然色素。藍(lán)靛果 （Lonicera edulis）是東北的野生漿果，其資源豐富，研究發(fā)現(xiàn)［1］藍(lán)靛果中83%的色素是矢車菊3－葡萄糖苷，其花色苷具有抗氧化、抗癌、改善視力等重要功能［2－3］，因此對這種天然色素進(jìn)行純化研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藍(lán)靛果（Lonicera edulis），采摘于大興安嶺；無水乙醇；乙酸鈉，乙酸；氯化鉀；鹽酸；大孔樹脂（AB－8，X－5，D101，D3520，NKA－9，ADS－17，NKA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子分析天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；離心機(jī)；精密pH計(jì)；紫外分光光度計(jì)；層析柱（規(guī)格20×600mm）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大孔樹脂的處理過程

將樹脂以無水乙醇浸泡24h，使其充分溶脹，然后以乙醇沖洗至加4～5倍體積的蒸餾水無白色渾濁為止，再以蒸餾水進(jìn)行沖洗，至加至4～5倍體積的無水乙醇無白色渾濁為止；再以5%的鹽酸溶液浸泡12h，蒸餾水洗至中性；最后用2%氫氧化鈉溶液浸泡12h，蒸餾水沖洗至中性備用。

1.3.2 pH 試差法的原理

花色苷發(fā)色團(tuán)隨pH值變化，而對花色苷顏色有干擾作用的褐色降解物則不隨pH值變化。利用花色苷及黃酮的結(jié)構(gòu)特性，pH值1.0時，二者在510nm處都有最大吸收峰；pH值4.5時，花色苷因?yàn)闀D(zhuǎn)變?yōu)闊o色查爾酮形式，故在510nm處無吸收，而黃酮仍會有吸收峰［4－7］。

1.3.3 藍(lán)靛果花色苷粗提液的制備

將冷凍的藍(lán)靛果鮮果500g，以料液比1∶10的比例加入60%的鹽酸酸化乙醇（pH2.0），50℃水浴攪拌浸提1.5h，3500r／min離心，濾渣以上述相同方法重復(fù)浸提2次，合并浸提液，真空抽濾50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得提取液備用。

1.3.4 緩沖液的配制

pH4.5的緩沖液的制備：準(zhǔn)確稱取1.64g乙酸鈉用蒸餾水定容100mL，用乙酸調(diào)pH（4.5±0.1）。

pH1.0的緩沖液的制備：準(zhǔn)確稱取1.49gKCl用蒸餾水定容至100mL。準(zhǔn)確量取1.7mL鹽酸用蒸餾水定容至100mL，配制成0.2moL／L鹽酸溶液，將KCI溶液與鹽酸溶液以25∶67的比例混合。用HCI溶液調(diào)pH（1.0±0.1）。

1.3.5 pH試差法的測定過程

取少量藍(lán)靛果花色苷提取液，稀釋至一定體積，進(jìn)行光譜掃描，確定其最大吸收波長。取稀釋后樣品1mL，加入pH值為1.0、4.5的緩沖溶液9mL，40℃水浴平衡20min后，以60%的酸化乙醇為空白，于最大波長下和700nm波長下測定其吸光度，計(jì)算其粗提液的濃度并凍干計(jì)算其純度。

1.3.6 計(jì)算

稀釋后樣品的吸光度ΔA按下式計(jì)算

花色苷含量按下式計(jì)算

花色苷含量（mg／mL）＝（ΔA×Mw×DF）／（ε×L）

式中：ΔA－吸光度；Mw－矢車菊3－葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2；DF－樣品總的稀釋倍數(shù)；ε－矢車菊3－葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26900mol－1；L－比色皿光程（一般為1cm）。

花色苷純度按下式計(jì)算：

純度（%）＝［（C×V）／m］×100%

式中：C－花色苷的含量，mg／mL；V－花色苷的體積，mL；m－花色苷干物質(zhì)的質(zhì)量，mg。

1.3.7 樹脂的篩選

不同樹脂的物理性質(zhì)有很大差別，因此它們對花色苷的吸附效果也必將有很大差別，將處理好的AB－8、X－5、D101、D3520、NKA－9、ADS－17、NKA 裝入層析柱中，徑長比為1∶20，上樣液的濃度為1.77mg／mL，上樣量為10mL；根據(jù)文獻(xiàn)［8］確定洗脫濃度為60%的乙醇溶液，洗脫流速為1mL／min，每柱用2BV洗脫液洗脫，每20mL接一段，每柱接8段，合并每柱中顏色最深的兩段，測定其濃度，篩選出純化藍(lán)靛果花色苷的最佳樹脂。

1.3.8 洗脫劑濃度的篩選

用篩選出的最佳樹脂，裝入5個層析柱中，分別用30%、40%、50%、60%、70%濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫的體積為2個柱體積，每20mL接一段，每柱接8段，合并每柱中顏色最深的兩段，測定其液體濃度，并將其凍干最終測定其純度。

1.3.9 上樣濃度的篩選

將藍(lán)靛果粗提液濃度進(jìn)行調(diào)整，使上樣濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg／mL，用上述最佳濃度的洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1mL／min，用2BV的洗脫液進(jìn)行洗脫，每20m為一段，每柱接8段，合并每柱中顏色最深的兩段，測定其液體濃度，并將其凍干最終測定其純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)靛果花色苷最大波長的確定

圖1 光譜掃描曲線

如圖1所示，藍(lán)靛果粗提液經(jīng)稀釋后，經(jīng)紫外掃描，在可見光區(qū)，其最大波長為峰1處的531nm，符合花色苷的最大吸收波長在可見光范圍內(nèi)的510～540nm附近的特征；在紫外光區(qū)，其最大吸收波長為峰2處的305nm，在300～330nm間，推測藍(lán)靛果花色苷中可能存在?；?］。為測量的方便，確定其測量波長為530nm。pH試差法得其粗提液濃度為1.77mg／mL，其純度為2.42%。

2.2 樹脂的篩選

圖2 不同樹脂對乙醇洗脫液中花色苷含量的影響

由圖2可知，弱極性的 AB－8和非極性的X－5、D101、D3520洗脫液中的花色苷的濃度較大，分別為0.264、0.311、0.340 和 0.288mg／mL，而 強(qiáng) 極 性 的NKA－9、ADS－17、NKA洗脫液中花色苷的濃度較小，分別為0.265、0.045和0.112mg／mL。根據(jù)文獻(xiàn)［9］，這些強(qiáng)極性的樹脂對花色苷的吸附率較大，而解析率卻是較小造成的。

2.3 洗脫劑濃度的篩選

洗脫劑的濃度對于洗脫效果有很大影響，以洗脫后獲得的較濃部分的純度來衡量洗脫的效果。

圖3 不同濃度的洗脫劑對花色苷的純度的影響

由圖3可知，在30%～70%洗脫劑的濃度范圍內(nèi)，隨著洗脫劑濃度的X增加，所獲得的洗脫物質(zhì)的純度逐漸增大，50%乙醇作為洗脫劑所獲得的花色苷的最濃部分的純度最高，達(dá)到了17.88%，乙醇濃度繼續(xù)增加，花色苷的純度反而下降，70%乙醇洗脫物中花色苷最濃部分的純度最小，只有13.56%，這是因?yàn)榛ㄉ罩杏胁蝗苡诖嫉牟糠郑淮罂讟渲綒埩粲谥卸槐幌疵搫┫疵摗?/p>

圖4 不同的上樣濃度對花色苷純度的影響

2.4 上樣濃度的篩選

由圖4可知，較低濃度的上樣液獲得的花色苷的純度不高，在上樣液為0.5mg／mL時，洗脫液中較濃部分花色苷的純度為12.70%，隨上樣濃度的增加，較濃部分花色苷的純度開始增加，當(dāng)上樣濃度達(dá)到1.5mg／mL時，較濃部分花色苷的純度達(dá)到最大值為14.70%，上樣濃度繼續(xù)增加，樹脂的吸附能力有限，導(dǎo)致花色苷殘留于柱隙中，在水洗時不能完全沖洗下來，因此導(dǎo)致花色苷的純度有所下降，但幅度不大。在濃度為2.0和2.5mg／mL 時，花色苷的純度分別為14.51%和14.42%。

3 結(jié)論

藍(lán)靛果花色苷中的大部分為矢車菊花色苷，而pH試差法是以矢車菊花色苷為標(biāo)準(zhǔn)花色苷，因此pH試差法是測定藍(lán)靛果花色苷的有效方法。

通過 pH 試差法測試 AB－8、X－5、D101、D3520、NKA－9、ADS－17、NKA七種大孔樹脂洗脫液中最濃部分的濃度，發(fā)現(xiàn)弱極性和非極性的樹脂的純化效果較好，其中以D101樹脂的純化效果最好，洗脫液中花色苷的濃度分別是0.340mg／mL；而極性和強(qiáng)極性的樹脂的純化效果較差。

花色苷有易溶于水和易溶于醇的部分，因此洗脫劑的濃度不同，洗脫的效果也不同，在30%～70%洗脫劑濃度范圍內(nèi)，50%濃度的乙醇的洗脫效果最好。

上樣濃度不同，獲得的花色苷的純度不同，濃度過大或過小，都不利于花色苷純化，上樣濃度為1.5mg／mL，獲得的花色苷純度達(dá)到最大，為14.70%。

［1］Renata Myjavcova，Petr Marhol，et al.Analysis of anthocyanin pigments in Lonicera（Caerulea）extracts using chromatographic fractionation by microcolumn liquid chromatography－mass spectrometry［J］.Journal of chromatography A，1217（2010）：7932－7941.

［2］李文星.藍(lán)靛果花色苷提取及其抗腫瘤功能機(jī)理的初步研究［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2011.

［3］楊玲.藍(lán)靛果提取物抗氧化及抗癌作用的研究［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2009.

［4］霍琳琳.桑葚紅色素的提取純化及結(jié)構(gòu)初步鑒定［D］.杭州：浙江大學(xué)，2006.

［5］趙慧芳，王小敏，間連飛，等.黑梅果實(shí)中花色苷的提取和測定方法研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，（5）：176－179.

［6］盧立真.紫甘薯花色苷的高效提取及抗衰老、抗糖尿病和抗腫瘤活性［D］.蘇州：蘇州大學(xué)，2010.

［7］唐琳，李子江，趙磊，等.兩種pH值法測定玫瑰花花色苷含量的比較［J］.食品科技，2009，30（8）：310－313.

［8］趙桂紅.藍(lán)靛果天然色素提取、精制條件及穩(wěn)定性研究［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

［9］田福.三種野生漿果花色苷的提取、純化及抗氧化活性研究［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2008.