氧化苦參堿抑制脂多糖所致小膠質細胞炎性因子分泌的實驗研究

董曉巧 杜 權 俞文華 張祖勇 朱 強 車志豪 陳 鋒 王 昊 陳 軍杭州市第一人民醫(yī)院 杭州 310006

氧化苦參堿是從豆科植物苦參、苦豆子等中分離出來的生物堿，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，具有抗炎作用[1-3]。但有關氧化苦參堿對體外培養(yǎng)小膠質細胞炎性因子分泌的影響研究少見報道。本研究觀察氧化苦參堿對脂多糖所致小膠質細胞白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）分泌的影響，從細胞水平探討氧化苦參堿的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 材 料 BV-2細胞購自中國醫(yī)學科學院協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學細胞中心，氧化苦參堿購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司，脂多糖購于美國sigma公司，IL-1β、TNF-α 和 IL-6 ELISA 試劑盒購自美國R&D systems公司。

1.2 分 組 設對照組、藥物組、脂多糖組及氧化苦參堿小、中、大劑量組，按 30 min、1 h、3 h 和 6 h 四個時間點分設4個亞組。對照組為BV-2細胞常規(guī)培養(yǎng)，藥物組為BV-2細胞常規(guī)培養(yǎng)加氧化苦參堿培養(yǎng)（氧化苦參堿終濃度為20 μg/mL），脂多糖組為BV-2細胞常規(guī)培養(yǎng)加脂多糖培養(yǎng)（脂多糖終濃度為1 μg/mL），小、中、大劑量組為 BV-2 細胞常規(guī)培養(yǎng)加小、中、大劑量氧化苦參堿培養(yǎng)（氧化苦參堿終濃度為 1、10、20 μg/mL）30 min，再加脂多糖培養(yǎng)（脂多糖終濃度為 1 μg/mL）。

1.3 細胞培養(yǎng) 細胞接種于血清滅活的DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1×105IU/L青霉素，l00 g/L鏈霉素），置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換新鮮培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)。將BV-2細胞按每孔2×104個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔體積200μL，每組設定6個重復孔，鏡下觀察，待細胞進入對數(shù)生長期，棄去孔內陳舊培養(yǎng)液，加入無血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2h使細胞周期同步化。按分組要求加入相應DMEM培養(yǎng)液，依次培養(yǎng)30 min、1 h、3 h 和 6 h。

1.4 指標檢測 在對應時間點，吸取各組每孔上清液，以12 000 r/min離心5 min，提取細胞上清液，于-70℃內保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)ELISA試劑盒說明書測定上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白的濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD法。

2 結果

2.1 氧化苦參堿預處理對脂多糖所致小膠質細胞IL-1β 分泌的影響 在30 min、1 h、3 h和6 h四個時間點，對照組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β濃度與藥物組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），脂多糖組IL-1β濃度顯著高于對照組（P＜0.05），氧化苦參堿小劑量組白介素-1β濃度與脂多糖組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），氧化苦參堿中劑量組IL-1β濃度顯著低于脂多糖組（P＜0.05），氧化苦參堿大劑量組白介素-1β濃度顯著低于氧化苦參堿中劑量組（P＜0.05），見表1。

表1 氧化苦參堿預處理對脂多糖所致小膠質細胞IL-1β分泌的影響（±s） pg/mL

表1 氧化苦參堿預處理對脂多糖所致小膠質細胞IL-1β分泌的影響（±s） pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.05；與脂多糖組比較，▲P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05

組 別對照組藥物組脂多糖組小劑量組中劑量組大劑量組n/孔666666 30min 28.0±4.2 26.3±3.9 142.7±6.7*138.3±5.6 98.0±4.9▲70.2±4.0△1 h 29.0±4.9 27.3±5.6 414.3±8.8*407.2±10.3 306.3±8.4▲274.2±7.3△3 h 27.3±4.7 26.0±3.4 508.3±11.5*499.3±8.5 348.2±6.7▲297.2±5.8△6 h 27.1±4.9 26.7±4.4 266.3±9.9*265.0±7.2 205.7±8.2▲176.3±7.3△

2.2 氧化苦參堿預處理對脂多糖所致小膠質細胞TNF-α分泌的影響 在30 min、1h、3h和6h四個時間點，對照組細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α濃度與藥物組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），脂多糖組TNF-α濃度顯著高于對照組（P＜0.05），氧化苦參堿小劑量組TNF-α濃度與脂多糖組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），氧化苦參堿中劑量組TNF-α濃度顯著低于脂多糖組（P＜0.05），氧化苦參堿大劑量組TNF-α濃度顯著低于氧化苦參堿中劑量組（P＜0.05），見表2。

表2 氧化苦參堿預處理對脂多糖所致小膠質細胞腫瘤TNF-α分泌的影響（±s） pg/mL

表2 氧化苦參堿預處理對脂多糖所致小膠質細胞腫瘤TNF-α分泌的影響（±s） pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.05；與脂多糖組比較，▲P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05

6 h 244.7±22.4 254.3±21.2 1752.3±110.3*1697.3±117.6 1354.6±122.7▲862.1±95.4△組 別對照組藥物組脂多糖組小劑量組中劑量組大劑量組n/孔666666 30 min 257.3±22.5 242.3±19.1 1424.0±67.8*1395.7±51.2 981.3±68.5▲665.7±58.6△1 h 260.7±21.8 248.7±24.6 2139.0±89.4*2167.7±68.9 1770.0±99.1▲1113.2±90.7△3 h 250.0±21.8 259.8±19.4 2785.2±151.5*2724.0±129.7 1965.3±136.3▲1482.7±124.5△

2.3 氧化苦參堿預處理對脂多糖所致小膠質細胞IL-6分泌的影響 在30 min、1 h、3 h和6 h四個時間點，對照組細胞培養(yǎng)上清液中IL-6濃度與藥物組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），脂多糖組IL-6濃度顯著高于對照組（P＜0.05），氧化苦參堿小劑量組IL-6濃度與脂多糖組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），氧化苦參堿中劑量組IL-6濃度顯著低于脂多糖組（P＜0.05），氧化苦參堿大劑量組IL-6濃度顯著低于氧化苦參堿中劑量組（P＜0.05），見表3。

表3 氧化苦參堿預處理對脂多糖所致小膠質細胞白介素-6分泌的影響（±s）pg/mL

表3 氧化苦參堿預處理對脂多糖所致小膠質細胞白介素-6分泌的影響（±s）pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.05；與脂多糖組比較，▲P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05

6 h 376.2±70.6 370.6±61.7 4632.2±200.7*4445.5±266.6 2755.5±288.5▲2070.3±182.8△組 別對照組藥物組脂多糖組小劑量組中劑量組大劑量組n/孔666666 30 min 383.8±52.2 365.5±56.2 2110.5±99.1*2062.2±73.2 1425.7±72.2▲1092.2±83.9△1 h 406.5±50.8 380.5±56.2 6185.5±130.5*6142.2±164.1 4125.5±149.3▲2795.5±134.5△3 h 381.2±50.1 360.5±48.4 7928.8±192.9*7815.7±132.9 5253.8±146.4▲3363.8±168.9△

3 討論

小膠質細胞在中樞神經系統(tǒng)具有保護和損害的雙重作用，活化的小膠質細胞一方面通過吞噬清除病原體和細胞碎片保護神經元，另一方面通過分泌一系列炎性因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等產生細胞毒效應[4-6]。因此，抑制小膠質細胞活化可對神經系統(tǒng)損傷起到一定的保護作用。

氧化苦參堿是從豆科植物苦參、苦豆子等中分離出來的生物堿，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，其化學分子式是C15H24N20，為白色針形棱柱形晶體或白色結晶性粉末，無臭、味苦，具有抗肝炎病毒、抗心律失常、抗癲癇，抗肝、腎和心臟纖維化、抗腫瘤等作用[7-12]。氧化苦參堿具有重要的抗炎作用，可作用于非特異性的炎癥反應，它的抗炎作用無需依賴垂體-腎上腺皮質系統(tǒng)；氧化苦參堿具有雙向調節(jié)的抗炎作用，低濃度時可刺激淋巴細胞增生，高濃度時則抑制淋巴細胞增生[13]。

氧化苦參堿也具有中樞神經系統(tǒng)抗炎作用，可降低腦組織核因子-κB水平，抑制神經系統(tǒng)炎癥反應，從而減少局灶性腦缺血大鼠的腦梗死面積[14]；可通過抑制12/15-脂氧合酶介導的絲裂原活化蛋白激酶信號通路從而保護腦缺血大鼠的神經功能[15]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可通過抑制Toll樣受體4/核因子-κB信號途徑，減少膠質細胞IL-1β、TNF-α和IL-6釋放，從而減少腦外傷大鼠神經細胞凋亡[16]。本研究觀察氧化苦參堿對脂多糖所致小膠質細胞IL-1β、TNF-α和IL-6分泌的影響，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿劑量依賴性地降低細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度。研究結果顯示，氧化苦參堿對脂多糖所致的小膠質細胞活化具有顯著的抑制作用，推測抗炎作用可能是氧化苦參堿神經保護的重要機制。

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