青蒿素衍生物對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

趙 昉 廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所 廣州 510405

鄭紹琴 廣州中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生

青蒿素是從中藥菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L）的葉中提取而來，其衍生物包括：青蒿素（artemisinin）、青蒿琥酯（artesunate，Art）、雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）等。青蒿素的藥理作用廣泛，包括抗瘧原蟲、抗腫瘤、免疫抑制、抗病毒、抗孕等多種活性藥理作用[1-4]。本研究通過對(duì)青蒿素、青蒿琥酯、雙氫青蒿素對(duì)肺癌A549增殖的影響，觀察不同青蒿素衍生物的抗腫瘤作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì) 胞 非小細(xì)胞肺癌A549，引自美國ATCC，由本室凍存?zhèn)鞔９堋?/p>

1.2 藥 物 青蒿素、雙氫青蒿素、青蒿琥酯，由廣東新南方青蒿科技有限公司提供。陽性藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)101103，規(guī)格0.25g/10 mL。1.3 試劑儀器 低糖DMEM、HEPES均購自美國GIBCO公司；小牛血清購自廣州畜牧場，批號(hào)20100618；L-谷氨酰銨和MTT均購自Sigma公司；其他相關(guān)產(chǎn)品為國產(chǎn)試劑。美國寶特ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀、全自動(dòng)CO2孵箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：HF90），倒置顯微鏡（日本 Olympus，型號(hào)CK40）、海爾生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司，型號(hào)：HR40-ⅡA2）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

初步檢測(cè)A549的細(xì)胞倍增時(shí)間和青蒿琥酯、雙氫青蒿素、青蒿素在A549的半數(shù)毒性濃度。結(jié)合初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取TC10作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度，觀察各青蒿素衍生物對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖的影響。

2.1 細(xì)胞接種 常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞后，待細(xì)胞生長至一定數(shù)量后，用0.25%胰酶消化1～5 min，終止消化，并用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)后用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×105/mL，按0.1 mL/孔接種于96孔細(xì)胞板上，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。

2.2 A549細(xì)胞生長曲線的繪制 按2.1方法接種細(xì)胞，于接種后每24 h做一次MTT染色。每天取4個(gè)復(fù)孔細(xì)胞進(jìn)行MTT染色，連續(xù)9天。最后結(jié)果以細(xì)胞MTT染色OD490為縱坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為橫坐標(biāo)，利用回歸法求出細(xì)胞增殖時(shí)間。

2.3 青蒿素衍生物半數(shù)毒性濃度TC50測(cè)定 按2.1方法接種細(xì)胞，根據(jù)A549生長曲線的結(jié)果，選取上藥時(shí)間為細(xì)胞接種后12 h，實(shí)驗(yàn)周期為4天。在接種細(xì)胞12 h后棄細(xì)胞上清液，按以下各青蒿素衍生物稀釋濃度加入細(xì)胞板中，0.1 mL/孔，4復(fù)孔/濃度。青蒿素起始濃度為20 mmol/L，雙氫青蒿素起始濃度為500 μmol/L，青蒿琥酯起始濃度為500 mol/L，各青蒿衍生物以倍比稀釋法稀釋，共8個(gè)梯度濃度。陽性藥物5-氟尿嘧啶起始濃度為20 mmol/L，4倍梯度稀釋共5個(gè)濃度，同時(shí)設(shè)置不加藥物的正常對(duì)照組和含1%DMSO的溶媒對(duì)照組。上藥后繼續(xù)于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4天，終止實(shí)驗(yàn)。用MTT法檢測(cè)各青蒿素衍生物對(duì)A549的毒性作用，在酶標(biāo)儀下以490nm波長讀取其OD值。按照下列公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=(正常對(duì)照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值）/(正常細(xì)胞對(duì)照組OD值－溶媒對(duì)照組OD值）×100%。再根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算各青蒿素衍生物的TC50。

2.4 青蒿素衍生物對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 根據(jù)2.3所得結(jié)果，選取青蒿素200μmol/L、雙氫青蒿素 5μmol/L、青蒿琥酯 8μmol/L、5-FU。在細(xì)胞接種24h后，棄上清液，分別加入含以上各濃度的青蒿素衍生物培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立只加正常培養(yǎng)基的對(duì)照組。0.1mL/孔，4個(gè)復(fù)孔/濃度，在上藥后分別于第 1、2、3、4、5、6 和第 7 天分別取樣做動(dòng)態(tài) MTT，觀察青蒿素衍生物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 A549細(xì)胞倍增時(shí)間的測(cè)定 通過回歸分析，A549細(xì)胞的倍增時(shí)間為9.6 h，生長高峰期在接種后的第4天出現(xiàn)。根據(jù)初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取細(xì)胞接種后12 h為上藥時(shí)間，實(shí)驗(yàn)周期選5天為1個(gè)周期。結(jié)果見表1。

表1 MTT法測(cè)定非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長曲線（±s）

表1 MTT法測(cè)定非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長曲線（±s）

OD 1天0.23±0.11 2天0.65±0.08 3天1.15±0.21 4天 5天1.22±0.17 1.18±0.13 490 6天1.05±0.23 7天 8天 9天0.64±0.01 0.58±0.21 0.33±0.05

3.2 青蒿素衍生物半數(shù)毒性濃度TC50的測(cè)定 在A549細(xì)胞上，青蒿素、雙氫青蒿素和青蒿琥酯的半數(shù)毒性濃度 TC50分別為 1.77 mmol/L、58.24 μmol/L、64.33 μmol/L。陽性對(duì)照物5-FU的半數(shù)毒性濃度為1.18 mmol/L。根據(jù)初步結(jié)果顯示，雙氫青蒿素和青蒿琥酯對(duì)A549肺癌細(xì)胞的抑制作用較好，其劑量濃度達(dá)到微摩爾水平。與雙氫青蒿素、青蒿琥酯相比，青蒿素的作用稍微差，為1.77 mmol/L，比陽性對(duì)照物5-FU稍大。顯示雙氫青蒿素抗肺癌A549作用最好，青蒿琥酯次之，青蒿素較差，見表2。

3.3 青蒿素衍生物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 正常對(duì)照組細(xì)胞的倍增時(shí)間為11.2 h，第4天達(dá)到生長高峰期，從第5天開始，由于受到接觸抑制和養(yǎng)分耗竭的影響，細(xì)胞活性逐漸下降。青蒿素200 μmol/L組的細(xì)胞倍增時(shí)間為9.6 h，在第5天到達(dá)生長高峰期后細(xì)胞活性迅速下降。青蒿琥酯8 μmol/L組的細(xì)胞倍增時(shí)間為27.8 h，在第5天到達(dá)生長高峰期后細(xì)胞活性迅速下降；雙氫青蒿素5 μmol/L組的細(xì)胞倍增時(shí)間為36.6 h，在第5天到達(dá)生長期，見圖1。

4 討論

近年研究顯示，青蒿素類藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，主要通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑完成。在青蒿素各衍生物中都有一個(gè)過氧化物橋活性基團(tuán)，在其抗瘧原蟲的研究中指明青蒿素抗瘧的機(jī)制是由于過氧化物橋可以與二價(jià)鐵反應(yīng)生成自由基，最終產(chǎn)生自由基活性代謝物,損傷蟲體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以達(dá)到抗瘧目的。有學(xué)者認(rèn)為青蒿素衍生物抗腫瘤的機(jī)制與抗瘧機(jī)制相似。由于鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)都較高[5]，尤其是進(jìn)入G1期細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)和鐵離子攝入都顯著增多[6]，因此青蒿素針對(duì)此周期的細(xì)胞具有特異性的靶向性，在高濃度的Fe2+離子催化作用下氧橋斷裂產(chǎn)生活性自由基，破壞細(xì)胞的線粒體的完整性，同時(shí)也可以通過調(diào)控細(xì)胞周期，下調(diào)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和Bcl-2基因的表達(dá)，影響拓?fù)洚悩?gòu)酶活性等，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。也有學(xué)者認(rèn)為，青蒿素類藥物可以通過線粒體依賴途徑，降低線粒體膜電位等途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。

表2 半數(shù)毒性濃度TC50的測(cè)定（±s）

表2 半數(shù)毒性濃度TC50的測(cè)定（±s）

TC50青蒿素 1.77mmol/L藥物濃度20mmol/L OD490 細(xì)胞抑制率/%0.24±0.03 96.23 10 0.28±0.13 88.68 5.0 0.39±0.08 67.94 2.5 0.45±0.21 56.60 1.25 0.52±0.04 43.30 0.625 0.58±0.17 32.08 0.312 0.67±0.09 15.09 0.156 0.73±0.24 -雙氫青蒿素 500μmol/L 0.20±0.05 100.00 58.24μmol/L 250 0.28±0.15 88.68 125 0.36±0.07 73.58 62.5 0.48±0.02 50.94 31.2 0.53±0.11 41.51 15.6 0.62±0.06 20.75 7.8 0.68±0.10 13.21 2.9 0.72±0.10 5.66青蒿琥酯 500μmol/L 0.15±0.05 100.00 64.33μmol/L 250 0.26±0.03 92.45 125 0.37±0.20 71.70 62.5 0.49±0.05 49.06 31.2 0.57±0.03 33.96 15.6 0.66±0.14 16.98 7.8 0.70±0.10 9.43 2.9 0.74±0.03 -5-Fu 20mmol/L 0.13±0.08 100.00 1.18mmol/L 5.0 0.27±0.17 90.57 1.25 0.48±0.07 50.94 0.31 0.62±0.06 24.53 0.078 0.69±0.10 11.32正常細(xì)胞對(duì)照 0.75±0.24 1%DMSO對(duì)照0.22±0.18

本實(shí)驗(yàn)初步顯示，青蒿素各衍生物的抗肺癌A549細(xì)胞的活性不相同。其中雙氫青蒿素和青蒿琥酯抗A549活性較好，青蒿素作用稍差。實(shí)驗(yàn)中雙氫青蒿素和青蒿琥酯都能延長細(xì)胞增殖時(shí)間，延緩細(xì)胞增殖周期，這與之前報(bào)道的青蒿素類藥物可以將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期的結(jié)果一致[8]。而青蒿素對(duì)A549的抑制作用并不明顯?；诓煌那噍锼匮苌飳?duì)同一腫瘤的抑制活性并不相同這一現(xiàn)象，這可能與化學(xué)藥物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。雙氫青蒿素為青蒿素經(jīng)四硼酸鈉還原所得，而青蒿琥酯的代謝產(chǎn)物是雙氫青蒿素，各衍生物的極性不同，或許會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)其攝取或結(jié)合的程度也不相同，從而影響藥物抗腫瘤活性。同時(shí)與體內(nèi)篩選系統(tǒng)相比，體外抗腫瘤篩選體系缺乏氧化還原代謝酶系統(tǒng)完整性，這也對(duì)前體藥抗腫瘤活性的研究有一定的影響。

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