TA方案對乳腺癌敏感率與DNA修復酶表達的相關(guān)性研究Δ

張曉麗 ，李海峰，李建鋒，劉開揚#，馬燕娜，杜，張鑫雨（.河北北方學院生命科學研究中心，河北張家口 07509；.河北北方學院法醫(yī)教研室，河北張家口 07509；.河北北方學院大學生科協(xié)，河北 張家口07509）

化學治療是乳腺癌綜合性治療的一部分，目前紫杉醇（Taxol，T）聯(lián)合阿霉素（Adriamy，A）方案在臨床有比較廣泛的應(yīng)用，而療效高低報道不一致，臨床普遍認為癌細胞對藥物的敏感性與生物學特性有關(guān)。本試驗通過免疫組化染色及原代癌細胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察并分析了83例乳腺癌中DNA修復酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）的表達與癌細胞對TA方案敏感率的關(guān)系。

表1 乳腺癌MGMT表達率及其他乳癌對TA方案的敏感率Tab 1 MGMT expression rate of breast carcinoma and susceptibility rate of breast cancer to TA scheme

表2 MGMT表達與TA方案敏感率的關(guān)系Tab 2 Relationship between MGMT expression and high sensitivity of TA scheme

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2004年9月－2006年7月河北北方學院第一附屬醫(yī)院乳腺癌切除標本83例，均為女性，年齡31～73歲，平均49.3歲。

1.2 儀器與試藥

5430型全自動二氧化碳（CO2）孵箱；DG-3022型酶標檢測儀（λ＝490 nm）；雙人超凈工作臺；96孔無菌培養(yǎng)板。

RPMI 1640培養(yǎng)液（美國GIBCOBRL公司）；小牛血清（上海伯奧生物科技公司）；二苯基溴化四氮唑鹽（美國SIGMA公司）；二甲基亞砜（DMSO）?？拱┧幬铮篢A方案（紫杉醇+阿霉素）。藥物使用的終濃度取臨床藥物血漿峰濃度的1/10（藥物濃度（μg·mL－1）＝60×D/5000÷50%×103。式中，D為臨床用藥劑量，單位為mg·kg－1；60為平均成人體重，單位為kg；50%為血細胞體積，單位為mL；乘以103后將mg換算為μg），計算得每毫升紫杉醇為960 μg，阿霉素為1.5 μg。免疫組化藥物：兔抗人MGMT多克隆抗體和SABC（（Strept avidin-biotin complex））試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)公司）；DAB顯色劑（北京中杉金橋公司）。

1.3 方法

將乳腺癌組織標本置1640培養(yǎng)液送檢，2 h內(nèi)開始試驗，分離癌細胞并計數(shù)，取含5×105個/100 μL的癌細胞懸液放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，加入化療藥物作用24 h后，每孔加入MTT 20 μL，4 h后棄上清液，每孔加DMSO 100 μL，10 min后檢測光密度（OD）值，波長選擇490 nm，并計算抑制率（IR）：

IR＝1－（加藥OD－不加藥OD）/不加藥OD×100%

免疫組化染色程序按試劑盒規(guī)程操作，微波進行抗原修復。陽性對照為已知陽性切片，陰性對照以PBS緩沖液代替Ⅰ抗。

1.4 判定標準

參考其他研究[1]，IR＞50%者為高敏感病例；IR為30%～50%者為敏感病例；IR＜30%者為不敏感病例；（高敏感病例+敏感病例）/總病例×100%＝總敏感率。MGMT陽性物為棕黃色，分布于細胞質(zhì)。在一張切片上取10個低倍視野。其中，陽性細胞＞15%為陽性病例，＜15%為陰性病例。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用四格聯(lián)列表法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

在乳腺癌中MGMT陽性（+）率為55.42%（46/83），TA方案敏感率為42.17%（35/83）。在不同病理類型中MGMT的表達組間比較無顯著性差異（P＞0.05），MGMT表達與淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，MGMT高表達與TA方案的敏感率呈低度相關(guān)（r＝0.23）。MGMT表達率及乳腺癌對TA方案敏感率和MGMT高表達與TA方案敏感率的關(guān)系詳見表1、表2。

3 討論

烷化劑是環(huán)境中普遍存在的一種致突變和致癌物質(zhì)，其作用于DNA后，形成O6-烷基鳥嘌呤化合物。如果組織中MGMT異常，不能發(fā)揮正常作用或作用不足時，O6-甲基鳥嘌呤不能被及時移走，在DNA復制中，該化合物與胸腺嘧啶錯配，發(fā)生G：C→A：T突變（鳥嘌呤：胞嘧啶錯配為腺嘌呤：胸腺嘧啶），導致癌基因激活和抑癌基因失活，進一步導致腫瘤發(fā)生[2，3]。人類MGMT基因定位于10q26上，全長約170 kb，是一種普遍存在的DNA修復酶，可將烷化劑在鳥嘌呤O6位形成的加合物移除，使存在DNA損傷的細胞不再增殖，從而保持基因組的完整性[4]，所以MGMT表達陽性的患者對烷化劑類化療藥物敏感。提示MGMT的檢測對于臨床化療藥物的選擇具有指導意義。本試驗中MGMT的陽性率為55.42%（46/83），并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組MGMT的陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.01），但在不同病理類型組中，MGMT表達無顯著性差異（P＞0.05）。

烷化劑的藥理作用是通過釋放活潑的烷化基團，使DNA鳥嘌呤第6位氧原子烷基化，O6-AG不能與胞嘧啶配對，而與胸腺嘧啶共價結(jié)合，形成具有高度細胞毒性的DNA交鏈，影響DNA復制，導致細胞死亡。而MGMT可使6-RG的烷基基團轉(zhuǎn)移到自身的半胱氨酸殘基上，對烷化劑導致的DNA損傷具有修復作用，影響了烷化劑類化療藥物療效。在腫瘤治療方面，MGMT拮抗藥能明顯逆轉(zhuǎn)腫瘤對烷基類藥物的耐藥性，增加烷基類藥物療效。如何調(diào)控MGMT表達以達到最佳化療效果，是目前腫瘤治療中較感興趣的問題。MGMT基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生及治療、預后的關(guān)系也將是今后該領(lǐng)域研究另一重要方向。

紫杉醇是1963年從太平洋西岸的短葉紫杉樹中發(fā)現(xiàn)對許多腫瘤細胞有細胞毒性作用的天然物質(zhì)。紫杉醇是一種新型抗微管藥物，其作用機制主要是促進微管蛋白的聚合，抑制微管的解聚，阻斷細胞周期M期和G期，從而阻止腫瘤細胞的增殖。近年來臨床研究[5～8]報道用紫杉醇單藥治療乳腺癌、肺癌、胃癌等，取得了良好成效。阿霉素為蒽環(huán)抗菌類化療藥物，對增殖細胞各期和G0期細胞都有作用，為細胞周期非特異性抗腫瘤藥物（CCNSA）。阿霉素抑制DNA合成的作用機制為：與DNA結(jié)合，作用于有絲分裂前期，從而抑制核酸合成和有絲分裂，誘導細胞死亡；自由基生成；與金屬離子結(jié)合；與細胞膜結(jié)合[9，10]。TA聯(lián)合方案，不僅使癌細胞分裂受阻，而停滯在G2期和M期，同時阿霉素阻斷（或抑制）DNA復制和RNA轉(zhuǎn)錄作用，導致細胞增殖停滯[11，12]，起到抗腫瘤作用。

本試驗顯示，乳腺癌患者對TA方案的總敏感率為42.17%（35/83），在46例MGMT陽性患者中，有24例對TA化療方案敏感，22例患者不敏感，通過四格聯(lián)列表法可知MGMT高表達與TA方案抑制率呈低度相關(guān)（r＝0.23），提示檢測MGMT在乳腺癌中的表達可以預測TA方案的敏感率。

本研究結(jié)果表明，乳腺癌細胞中MGMT的表達水平可以預測TA方案對乳腺癌的治療效果。因此，檢測乳腺癌中MGMT的表達狀況對于臨床化療方案的選擇有一定指導意義。

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