慢性肝病患者肝螺桿菌血清抗體水平分析

李紅艷 張永貴 王 靜 季尚瑋 斯慶圖娜拉 王江濱 (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130033)

1992年，美國國立癌癥研究所的病理學(xué)家在患有肝細(xì)胞癌的A/JCr小鼠的體內(nèi)分離出一種新型螺桿菌，命名為肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus，H.hepaticus)〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，健康小鼠腹腔注射肝螺桿菌后，可出現(xiàn)慢性活動(dòng)性肝炎，并在肝細(xì)胞外間隙及肝內(nèi)膽道系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)菌體，因此肝螺桿菌可能成為這種成年小鼠發(fā)生慢性肝炎及伴隨肝細(xì)胞癌的病因?qū)W因素。關(guān)于螺桿菌屬在人類肝臟疾病中可能起的作用知之甚少，但是在膽汁中通過 PCR檢測(cè)到 H.pylori的 DNA。Fox等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)H.hepaticus，H.bilis以及其他腸肝螺桿菌可能在慢性膽囊炎和慢性肝病的發(fā)病中起作用。本研究比較不同人群血清中抗H.hepaticus－IgG抗體和抗 H.pylori－IgG抗體反應(yīng)，同時(shí)分析兩種螺桿菌抗原之間的交叉反應(yīng)，為進(jìn)一步了解H.hepaticus在慢性肝病中可能起的協(xié)同作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 (1)病例組為吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院消化內(nèi)科2007年10月至2009年6月期間不同肝病患者76名〔男50例，女26例，平均年齡(40.7±15.8)歲〕;診斷基于病史、生化學(xué)、免疫學(xué)和肝組織學(xué)檢查。血清酶學(xué)升高和/或臨床癥狀持續(xù)超過6個(gè)月可診斷為慢性疾病，其中慢性病毒性肝病患者52例(慢性乙型病毒性肝病27例、慢性丙型病毒性肝病25例)，自身免疫性肝炎8例和慢性酒精性肝病16例，患者合并有肝硬化25例。(2)正常體檢人群:作為成年人代表性樣本，隨機(jī)選自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院體檢中心80例，正常體檢人群〔男44例，女36例，平均年齡(43.8±16.4)歲〕。(3)健康獻(xiàn)血者:80例隨機(jī)選自長(zhǎng)春市中心血站，男42例，女性38例，平均年齡(35.6±10.6)歲。所有標(biāo)本均檢測(cè)HBV和HCV陰性。所有標(biāo)本保存在－20℃。

1.2 H.hepaticus、H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株及培養(yǎng) H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51450購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心(ATCC)，H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1由中國疾病控制中心診斷室提供。H.hepaticus、H.pylori凍存菌株經(jīng)布氏瓊脂培養(yǎng)基復(fù)蘇，于微需氧(5%O2，10%CO2，85%N2)、37℃、高濕度條件下分別培養(yǎng)7～10 d、3～4 d，可疑菌落經(jīng)鑒定為 H.hepaticus及 H.pylori后進(jìn)行純培養(yǎng)2～3代，備用。

1.3 H.hepaticus、H.pylori抗原制備 分別選取穩(wěn)定傳代的H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51450及H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1，用無菌生理鹽水洗脫固體平板上的細(xì)菌，4℃、3000 r/min離心10 min后棄上清，重新加入生理鹽水并用毛細(xì)細(xì)管吹打，懸浮后再離心，收集細(xì)菌。然后用小體積無菌生理鹽水懸浮，冰浴超聲粉碎10 min，4℃、12000 r/min離心20 min，收集上清。細(xì)菌殘?jiān)俪暦鬯?0 min，重復(fù)上述過程一次。合并兩次上清，測(cè)蛋白濃度，分裝后置－80℃保存，備用。

抗原濃度計(jì)算:超聲粉碎細(xì)菌抗原稀釋后，用U－341紫外可見分光光度計(jì)測(cè)260 nm和280 nm波長(zhǎng)的吸光度值(A260、A280)，按下列公式計(jì)算濃度:

蛋白濃度(mg/ml)=(1.74×A280－0.75×A260)×稀釋倍數(shù)。

1.4 抗H.hepaticus、H.pylori多克隆抗體的制備 2 ml弗氏佐劑(首次免疫時(shí)應(yīng)用弗氏完全佐劑，以后應(yīng)用弗氏不完全佐劑)加熱后，放入無菌研缽內(nèi)，冷卻后緩慢分別滴入已獲得的H.hepaticus、H.pylori超聲粉碎抗原(200 μg/ml)2 ml，研磨至乳白色黏稠的油包水乳劑。免疫方法采用背部多點(diǎn)注射法，即在家兔脊柱兩旁選6點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)注射0.2 ml，間隔10 d后再于上述部位選不同點(diǎn)注射。每次免疫的抗原量約100 μg。每次免疫1 w后，耳緣靜脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。當(dāng)效價(jià)在1∶16以上時(shí)心臟采血分離血清制備抗H.hepaticus及抗H.pylori抗體。

1.5 血清抗 H.hepaticus－IgG抗體、抗 H.pylori－IgG抗體檢測(cè)

應(yīng)用H.hepaticus、H.pylori超聲粉碎抗原包被ELISA反應(yīng)板。將1∶100稀釋的待測(cè)血清100 μl加入H.hepaticus抗原包被的ELISA反應(yīng)孔中，H.hepaticus、H.pylori抗原免疫兔子獲得的多克隆抗體作為陽性對(duì)照，H.hepaticus、H.pylori抗原免疫兔子前的血清作為陰性對(duì)照，PBS作為空白對(duì)照，封蓋后37℃孵育1 h。用漂洗液漂洗3次。每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(待測(cè)血清中加羊抗人二抗，陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照中加羊抗兔二抗)(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠及抗兔二抗由華特生生物技術(shù)有限公司提供)稀釋液(1∶500)100 μl，封蓋后37℃孵育1 h。漂洗3次后每孔加入顯色液100 μl，37℃避光顯色20 min，加入0.2 N的硫酸終止顯色。在酶標(biāo)儀上讀取450 nm的光密度(OD)值。ELISA結(jié)果用相對(duì)抗體活性(relative antibody activity RAA)表示，RAA是參照標(biāo)準(zhǔn)(丙種球蛋白，山西康寶生物制品股份有限公司)的百分?jǐn)?shù)作為吸光率值的修正均值。比較三組每種螺桿菌的RAA均值。

1.6 吸收試驗(yàn) 為了吸收可能的抗體交叉反應(yīng)，超聲處理H.pylori整個(gè)細(xì)胞，收集 H.pylori細(xì)胞用PBS(pH7.2)洗滌1次，冰內(nèi)超聲處理8次，每次60 s，每次間隔30 s，平均輸出功率45 W。將1 ml超聲處理的細(xì)胞加入到PBS中，加入10 μl血清，在22℃孵育1 h，然后在6°C不停搖勻16 h。12000 r/min離心10 min移去細(xì)胞，收集上清液用于血清學(xué)檢查。作為對(duì)照，H.pylori抗體完全吸收，被吸收后的血清再次做ELISA，三組人群中H.pylori平均RAA值均低于吸收試驗(yàn)前的水平。

2 結(jié)果

2.1 吸收試驗(yàn)前后三組人群抗H.hepaticus－IgG和抗H.pylori－IgG抗體的相對(duì)抗體活性分析 吸收實(shí)驗(yàn)前CLD患者抗H.hepaticus－IgG抗體RAA平均值明顯高于獻(xiàn)血者組和普通體檢人群組(P＜0.001);CLD患者和普通體檢人群抗H.pylori－IgG抗體的RAA平均值明顯高于獻(xiàn)血者(P＜0.001)。CLD組抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA平均值在吸收試驗(yàn)前后差異無顯著性變化(P＞0.05);普通體檢人群和獻(xiàn)血者抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA平均值在吸收試驗(yàn)后有所增高，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 吸收試驗(yàn)前后三組人群抗H.hepaticus和H.pylori抗體的相對(duì)抗體活性(±s)

表1 吸收試驗(yàn)前后三組人群抗H.hepaticus和H.pylori抗體的相對(duì)抗體活性(±s)

與CLD組比較:1)P＜0.001;與獻(xiàn)血組比較:2)P＜0.001

H.pylori CLD組 76 40.85±16.92 35.79±16.8041.23±18.502)組別 n 吸收實(shí)驗(yàn)前 吸收實(shí)驗(yàn)后體檢人群組 80 25.52±7.87 30.46±11.2242.10±11.342)獻(xiàn)血者組 80 17.93±7.321)18.22±7.11 27.26±8.03

2.2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對(duì)抗體活性分析 CLD患者中除自身免疫性肝炎患者外，慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎及酒精性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA均明顯增高，慢性丙型肝炎患者抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA值明顯高于其他肝病患者(P＜0.001)，吸收試驗(yàn)前后抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA值無顯著性變化(P＞0.05)。見表2。

表2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus抗體的相對(duì)抗體活性(RAA，±s)

表2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus抗體的相對(duì)抗體活性(RAA，±s)

與丙肝患者比較:1)P＜0.001

組別 吸收試驗(yàn)前 吸收試驗(yàn)后乙肝患者(n=27) 34.70±12.021) 28.55±12.631)丙肝患者(n=25) 57.68±13.27 50.72±16.07自身免疫性肝炎(n=8) 17.83±4.241) 17.77±3.231)酒精性肝病(n=16) 32.97±8.261) 31.65±8.181)

3 討論

H.hepaticus自發(fā)現(xiàn)并分離至今，國內(nèi)外研究顯示在世界范圍內(nèi)不同品系實(shí)驗(yàn)室小鼠中均不同程度存在H.hepaticus感染〔3〕。H.hepaticus主要定植于小鼠的下胃腸道及肝臟，除A/JCr小鼠外，還能誘發(fā) C3H/HeNCr、BALB/cAnNCr、SCID/NCr等多種品系的小鼠發(fā)生腸道炎癥及慢性活動(dòng)性肝炎，甚至并發(fā)肝癌〔1，4〕。螺桿菌菌屬是一組革蘭陰性、微需氧螺旋彎曲狀細(xì)菌，最初從人類及其他哺乳動(dòng)物的胃組織中分離出來的〔5〕，研究顯示這類細(xì)菌可能與人或動(dòng)物的胃腸道、肝膽系統(tǒng)和一些惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)〔6，7〕。因此進(jìn)一步研究這些新型螺桿菌在人類肝病中可能的作用具有重要意義。

本研究三組人群中慢性肝病患者吸收試驗(yàn)后H.hepaticus抗體反應(yīng)仍保持較高水平，同時(shí)慢性肝病患者中除自身免疫性肝炎患者外，慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎及酒精性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對(duì)抗體活性均明顯增高，慢性丙型肝炎患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對(duì)抗體活性明顯高于其他肝病患者，表明這種螺桿菌抗原或其他未被鑒定的螺桿菌的抗體反應(yīng)具有特異性，這種微生物有可能參與了慢性肝病的發(fā)病機(jī)制。在普通人群和獻(xiàn)血者吸收試驗(yàn)后H.hepaticus的抗體反應(yīng)反而有所增加，這一發(fā)現(xiàn)目前還無法解釋。

Roe等〔8〕在各種膽管疾病患者的膽汁中檢測(cè)螺桿菌DNA，應(yīng)用螺桿菌屬特異性PCR在原發(fā)硬化性膽管炎和原發(fā)膽汁性肝硬化患者肝組織中檢測(cè)到螺桿菌包括H.pylori。在近50%患者膽汁和肝臟標(biāo)本螺桿菌DNA陽性。在另一研究中〔9〕，膽管癌、肝細(xì)胞癌患者應(yīng)用螺桿菌屬特異性引物檢測(cè)71%和75%肝臟標(biāo)本螺桿菌屬PCR陽性。最近，一種與H.pylori相似的菌株從肝豆?fàn)詈俗冃愿斡不曰颊叩母闻K中分離出來，證實(shí)螺桿菌可以感染人類肝臟。

總之，在本研究中發(fā)現(xiàn)H.hepaticus和H.pylori的細(xì)胞表面蛋白具有較高的交叉反應(yīng)，提示菌屬特異性具有免疫原性蛋白用于酶免疫測(cè)定時(shí)需要鑒定和純化。慢性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對(duì)抗體活性在吸收試驗(yàn)后仍保持較高水平，這些發(fā)現(xiàn)提示在慢性肝病患者體內(nèi)存在H.hepaticus的感染，但其在人類肝病發(fā)生發(fā)展中可能的協(xié)同致病作用還需要進(jìn)一步研究探討。

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