葉酸、維生素B12對高同型半胱氨酸血癥大鼠ICAM-1及VCAM-1表達(dá)的影響

王 新 郭曉林 王玉玲 姜雅秋 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管中心，吉林 長春 300)

目前國內(nèi)外大量研究表明，高同型半胱氨酸(Hhcy)是動脈粥樣硬化(AS)的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子〔1，2〕，血管壁免疫炎癥反應(yīng)可能是Hhcy致AS的機(jī)制之一〔3〕。細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAM)是位于細(xì)胞膜表面的大分子跨膜糖蛋白，在炎癥反應(yīng)過程中起重要的作用〔3〕。葉酸、維生素B12是Hhcy代謝的輔助因子，可降低體內(nèi)同型半胱氨酸(Hcy)的水平;但是通過補(bǔ)充葉酸和維生素B12是否能防止AS的進(jìn)展，目前國內(nèi)尚未報(bào)道。本研究通過觀察葉酸、維生素B12對Hhcy大鼠主動脈壁細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)及血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討Hhcy導(dǎo)致AS的機(jī)制及葉酸、維生素B12對AS的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 8周齡雄性SD大鼠，體重190～210 g，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(遼)2003-0016。飼料為繁育鼠全價(jià)固體顆粒飼料，沈陽市于洪區(qū)前民動物飼料廠提供。蛋氨酸(Sigma公司，C7352)。葉酸(片劑)，天津飛鷹制藥有限公司生產(chǎn)(20060408)。維生素B12(片劑)，山西云鵬制藥有限公司生產(chǎn)(20061107)。ICAM-1、VCAM-1、免疫組織化學(xué)染色用一抗、二抗，購于北京中山生物技術(shù)工程公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及標(biāo)本采集 將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組，每組8只?？瞻讓φ战M:喂食基礎(chǔ)飼料，每日灌胃給予生理鹽水5 ml/kg。HHcy模型組:喂食高蛋氨酸飼料(基礎(chǔ)飼料中加入1.7%蛋氨酸)+每日灌胃給予生理鹽水5 ml/kg。葉酸、B12干預(yù)組:喂食高蛋氨酸飼料 +每日灌胃給予葉酸3.5 mg/kg、維生素B127 μg/kg。干預(yù)藥物每日用量為成人常用量等效劑量的4～6倍。各組SD大鼠連續(xù)灌胃給藥8 w，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，于8 w處死所有大鼠，取血10 ml、升主動脈近心段0.5 cm。

1.2.2 主動脈壁形態(tài)學(xué)觀察 將所取主動脈10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，將切片置于光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.2.3 應(yīng)用ELISA法檢測血漿Hcy水平。

1.2.4 應(yīng)用鏈親素卵白素-過氧化物酶(SP)法檢測主動脈壁ICAM-1和VCAM-1的表達(dá) 取組織切片脫蠟水化，0.3%H2O2甲醇處理切片20 min，蒸餾水、磷酸鹽緩沖液(PBS)各洗5 min。用枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)15 min，取出迅速冷卻，PBS洗3次，1 min/次。滴加封閉液，37℃孵育20 min，傾去不洗。分別加入用PBS按1∶100稀釋的ICAM-1和VCAM-1一抗37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次2 min。加入二抗，37℃孵育20 min。PBS洗3次，每次2 min。加入SP復(fù)合物孵育20～30 min。PBS洗3次，每次2 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)-H2O237℃孵育10 min。PBS洗，蒸餾水洗。Harris蘇木素染核10 min。蒸餾水洗，分化，藍(lán)化，脫水，透明并封固。光鏡下觀察，每片隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)數(shù)。設(shè)立陰性對照(以PBS代替一抗)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用成組單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 主動脈壁形態(tài)學(xué)觀察 空白對照組血管壁結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮下未見脂質(zhì)及炎性細(xì)胞浸潤，中層及外膜結(jié)構(gòu)清楚，未見病理改變;Hhcy模型組可見血管壁彌漫性隆起，突向管腔面，形成明顯斑塊，內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜下大量排列不規(guī)則平滑肌細(xì)胞(SMC)增生，內(nèi)有脂質(zhì)沉積，形成大小不等、形態(tài)不規(guī)則的泡沫細(xì)胞，膠原纖維和彈性纖維增多，內(nèi)膜中有大量巨噬細(xì)胞浸潤，中層結(jié)構(gòu)紊亂，平滑肌增生、壞死，并有炎性細(xì)胞浸潤，彈力板處及細(xì)胞間隙可見大量脂質(zhì)沉積;葉酸、維生素B12干預(yù)組與HHcy模型組比較，胸主動脈血管壁無明顯隆起，內(nèi)膜下有少許炎性細(xì)胞浸潤，中層平滑肌無明顯增生，未見泡沫細(xì)胞。見圖1。

2.2 各組血漿Hcy水平比較 各組血漿Hcy水平具有差異，Hhcy模型組的血漿Hcy水平明顯高于空白對照組(P＜0.01)。Hhcy模型組血漿Hcy水平明顯高于葉酸、維生素B12干預(yù)組(P＜0.01)。見表1。

圖1 三組主動脈壁形態(tài)學(xué)觀察(HE，×100)

2.3 各組血管壁ICAM-1、VCAM-1表達(dá) 各組血管壁ICAM-1、VCAM-1表達(dá)水平具有差異，Hhcy模型組的血管壁 ICAM-1、VCAM-1表達(dá)明顯高于空白對照組(P＜0.01)。Hhcy模型組血管壁ICAM-1、VCAM-1表達(dá)明顯高于葉酸、維生素B12干預(yù)組(P＜0.01)，但是仍高于空白對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 血漿 Hcy、血管壁ICAM-1、VCAM-1在各組中的表達(dá)水平( ± s，n=8)

表1 血漿 Hcy、血管壁ICAM-1、VCAM-1在各組中的表達(dá)水平( ± s，n=8)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與Hhcy模型組比較:2)P＜0.01

組別 血漿Hcy(μmol/L)主動脈壁ICAM-1(%) VCAM-1(%)7.39±2.46 15.04±4.59 18.75±3.17 Hhcy模型組 115.04±10.971) 52.51 ±7.941) 55.86±11.561)葉酸、B12組 16.13±1.152) 23.35±4.692) 28.55±3.632)空白對照組

3 討論

ICAM-1和VCAM-1是近年研究較多的細(xì)胞膜表面大分子跨膜糖蛋白，是細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的一類黏附物質(zhì)的總和，屬于免疫蛋白超家族的一員，可促進(jìn)血液中游走的單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞黏附，進(jìn)入炎癥部位，導(dǎo)致AS形成〔4〕。Neville等發(fā)現(xiàn)長期接觸Hcy的上皮細(xì)胞ICAM-1、組織型纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的表達(dá)水平升高，且ICAM-1，PAI-1表達(dá)水平與內(nèi)皮衰老程度呈正相關(guān)〔5〕。Koga等〔6〕同時(shí)發(fā)現(xiàn)人動脈內(nèi)皮細(xì)胞在Hcy刺激下可增加表面黏附分子VCAM-1和E-選擇素的表達(dá)和mRNA水平。本研究表明，Hhcy模型組ICAM-1和VCAM-1表達(dá)水平較空白對照組明顯上調(diào)，進(jìn)一步表明ICAM-1和VCAM-1參與了Hhcy所致AS形成過程。

Hcy又稱高半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，為蛋氨酸脫甲基后的產(chǎn)物。維生素B12是Hcy代謝的輔酶，可使5-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，所供出的甲基由Hcy獲得在蛋氨酸合成酶作用下形成蛋氨酸。如維生素B12降低可使Hcy形成蛋氨酸受阻，造成Hcy水平升高。葉酸缺乏時(shí)，可導(dǎo)致Hcy再次甲基化生成蛋氨酸受阻，同時(shí)還影響亞甲基四氫葉酸還原酶的活性，進(jìn)一步影響甲基四氫葉酸的生成，是影響Hcy水平的最主要因素〔7〕。黃延焱等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)血清葉酸、維生素 B12濃度與血清Hcy水平呈負(fù)相關(guān)，增加葉酸、B族維生素的攝入可降低Hcy水平。本組觀察表明，葉酸、維生素B12干預(yù)組Hcy水平明顯低于Hhcy模型組，與國內(nèi)外研究相符。同時(shí)根據(jù)光鏡下動脈壁形態(tài)學(xué)觀察可發(fā)現(xiàn)葉酸、B12干預(yù)組與Hhcy模型組比較主動脈血管壁無明顯隆起，內(nèi)膜下有少許炎性細(xì)胞浸潤，中層平滑肌無明顯增生，未見泡沫細(xì)胞。說明補(bǔ)充葉酸和維生素B12可減輕Hhcy動脈粥樣硬化程度，對Hhcy致AS具有明顯預(yù)防作用。

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6 Koga T，Claycombe K，Meydani M.Homocysteine increases monocyte and T-cell adhesion to human aortic endothelial cells〔J〕.Atherosclerosis，2002;161(2):365-74.

7 Skurk C，Walsh K.Death receptor induced apoptosis:a new mechanism of homocysteine-mediated endothelial cell cytotoxicity〔J〕.Hypertension，2004;43(6):1168-70.

8 黃延焱，盧曉哲，程梅芬.老年腦梗死患者血清同型半胱氨酸水平及藥物干預(yù)研究〔J〕.中國臨床康復(fù)，2003;7:1112-3.