衰老因素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂等指標(biāo)的影響

遲惠英 陳 川 郁志華 陳久林 申定珠 邢三麗 趙紅彬

(上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海 200031)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)性疾病形成機(jī)制，有脂質(zhì)浸潤(rùn)、炎癥、血栓形成、單克隆、氧化應(yīng)激等多種學(xué)說(shuō)〔1〕，目前認(rèn)為上述幾種學(xué)說(shuō)均無(wú)法完全解釋其形成機(jī)制。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，AS患者端?？s短及端粒酶活性降低，這即明確其在本質(zhì)上是增齡性的退行性病變。AS的模型多是基于高脂飲食，很少將衰老因素納入其中，這便與實(shí)際存在一定的脫節(jié)。在臨床上即可見(jiàn)一些有著頸動(dòng)脈斑塊但是血脂正常的老年人。為此，本研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將高脂飼料合并腹腔注射維生素D3建立的經(jīng)典AS模型，與皮下注射D-半乳糖建立的亞急性衰老模型相結(jié)合，建立AS與衰老符合模型，并通過(guò)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，探討衰老在動(dòng)脈硬化形成過(guò)程中所起的作用，及其對(duì)血脂等指標(biāo)的影響，亦以有助于AS模型設(shè)計(jì)的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡健康雄性SD大鼠，體重(200±20)g，購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1.2 試劑與儀器 注射用維生素D3(上海通用藥業(yè)股份有限公司)，D-半乳糖粉劑(BIO BASIC INC)，總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、氧化型LDL(ox-LDL)試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)，丙二醛(MDA)測(cè)試試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成公司)。Power Wave XS微孔板分光光度計(jì)(BioTek)。

1.3 模型建立 在清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)環(huán)境下給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，將SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，分別為正常組，模型組(AS組)，衰老組，AS+衰老組。正常組及衰老組給予普通飼料，AS組及AS+衰老組給予高脂飼料(高脂飼料配方:3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.12%丙硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.38%基礎(chǔ)飼料)，各組自由飲食。參照文獻(xiàn)〔2〕所用維生素D3總劑量，按用藥時(shí)間及大鼠體重變化進(jìn)行計(jì)算，并將傳統(tǒng)腹腔注射的方法改為灌胃以減小藥物的刺激作用，AS組每周以150 U/g維生素D3灌胃。D半乳糖組造模方法參照文獻(xiàn)〔3〕，每天以100 mg/kg D-半乳糖皮下注射。AS+衰老組灌胃維生素D3同時(shí)皮下注射D-半乳糖。灌胃量為1 ml，皮下注射量為0.2 ml。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法 14 w后，將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，每只取5 ml注入非抗凝玻璃管中，室溫靜置2 h，3000 r/min離心15 min，取上清分裝在2 ml EP管中，－80℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)時(shí)將血清和試劑盒從冰箱中取出，平衡至室溫。按說(shuō)明書(shū)要求配成各種工作液，以空白管調(diào)零，按說(shuō)明書(shū)要求，測(cè)定相應(yīng)波長(zhǎng)的吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s表示，方差齊時(shí)多組計(jì)量資料采用單因素方差分析;若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組脂代謝相關(guān)指標(biāo)水平的測(cè)定 見(jiàn)表1。與正常組比較，各實(shí)驗(yàn)組TC、LDL-C水平明顯上升(P＜0.05)。AS+衰老組HDL-C含量與正常組有差別(P＜0.05)。動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)各實(shí)驗(yàn)組與正常組均有差異(P＜0.05)。對(duì)AS+衰老組與AS組和衰老組分別進(jìn)行比較，以上四項(xiàng)指標(biāo)均有明顯差異(P＜0.05)。與正常組比較，AS組、AS+衰老組TG水平升高(P＜0.05)。ox-LDL水平AS+衰老組與正常組有差別(P＜0.05)。AS+衰老組與AS組和衰老組分別進(jìn)行比較，在ox-LDL和TG含量方面均可見(jiàn)升高趨勢(shì)，部分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組SOD及MDA水平比較 見(jiàn)表2。與正常組比較，其他實(shí)驗(yàn)組血清MDA水平有升高趨勢(shì)，AS+衰老組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清SOD水平均降低(P＜0.05)。證明無(wú)論是AS、衰老還是衰老伴隨AS都可以導(dǎo)致血清SOD水平的降低。

表1 各實(shí)驗(yàn)組血脂水平比較( ± s，mmol/L)

表1 各實(shí)驗(yàn)組血脂水平比較( ± s，mmol/L)

與正常組比較:1)P＜0.05;與AS組比較:2)P＜0.05;與衰老組比較:3)P＜0.05

56±1.32 1.06±0.28 AS組 9 1.78±1.451) 0.60±0.15 4.88±1.151) 2.97±2.321) 4.43±1.62 2.80±2.021)3)AS+衰老組 7 3.37±1.581)2)3) 0.35±0.161)2)3) 6.29±1.221)2)3) 11.71±6.571)2)3) 8.77±1.811)2) 2.16±1.221)3)衰老組 7 1.53±0.831)3) 0.59±0.14 2.44±0.931)2) 2.49±1.341) 4.26±2.08 1.10±0.282)LDL-C HDL-C TC AI ox-LDL TG正常組 8 0.36±0.24 0.76±0.26 1.14±0.32 0.46±0.30 3.組別 n

表2 各實(shí)驗(yàn)組血清MDA及SOD水平比較(±s)

表2 各實(shí)驗(yàn)組血清MDA及SOD水平比較(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與衰老組比較:2)P＜0.05

組別 n MDA(nmol/ml) SOD(U/ml)8 10.58±2.96 155.78±2.82 AS組 9 11.54±1.54 147.45±3.021)AS+衰老組 7 12.82±1.221)2) 149.58±3.991)衰老組 7 10.44±1.46 146.78±7.091)正常組

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道的可以引起AS的危險(xiǎn)因素距今為止已有300多個(gè)，高脂血癥、高血壓、吸煙、糖尿病等是最早被公認(rèn)的重要的危險(xiǎn)因素。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，LDL、血清TC水平升高與AS發(fā)病率呈正相關(guān)〔4〕。經(jīng)氧化修飾的ox-LDL能夠刺激巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞和血小板的黏附、聚集，平滑肌細(xì)胞增生，從而促進(jìn)血栓形成，促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展〔5〕。經(jīng)氧化應(yīng)激后產(chǎn)生的ROS可以將LDL氧化生成ox-LDL，并進(jìn)一步通過(guò)造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷、導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖來(lái)促進(jìn)AS的發(fā)展演化。氧化應(yīng)激后生成的ROS可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活化因子AP-1和核因子NF-κB信號(hào)的表達(dá)，促進(jìn)炎癥有關(guān)的基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。與LDL相反，HDL具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用〔6〕。它可以抵抗LDL的氧化修飾作用，參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，減少脂質(zhì)在血管壁的沉積。HDL還能保護(hù)內(nèi)皮屏障功能，降低細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，具有保護(hù)動(dòng)脈血管的作用〔7〕。本實(shí)驗(yàn)中，各模型組大鼠血清 TC、TG、LDL、AI、ox-LDL含量都有所升高，HDL水平降低，以AS+衰老組變化最為明顯，證明經(jīng)老化因素干預(yù)后，復(fù)合模型大鼠血脂較單純AS模型變化明顯。

AS時(shí)可以導(dǎo)致血清中SOD降低〔8〕。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，其水平高低可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而間接反映出細(xì)胞損傷的程度〔9〕。MDA通常與SOD相配合以反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度和機(jī)體清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AS后血清中SOD降低而MDA相應(yīng)的增高，證實(shí)AS后機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力減弱，而脂質(zhì)過(guò)氧化程度加重。而AS+衰老組該項(xiàng)指標(biāo)變化較另外兩造模組明顯，也證實(shí)了增齡在AS的形成過(guò)程中起到了一定作用。

流行病學(xué)調(diào)查表明，端粒長(zhǎng)度的縮短與冠心病、腦卒中等AS性疾病的發(fā)生率隨年齡的增加而上升，而這與端粒、端粒酶隨增齡的變化趨勢(shì)也是一致的〔10〕。Benetos等〔11〕選取了163例高血壓男性用B超檢查是否存在頸動(dòng)脈粥樣斑塊，同時(shí)測(cè)量起白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度。將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，高血壓伴有頸動(dòng)脈粥樣斑塊的患者，其白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度較無(wú)頸動(dòng)脈粥樣斑塊的高血壓患者明顯縮短，說(shuō)明白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的縮短與頸動(dòng)脈粥樣硬化的易患性有關(guān)。我所林水淼教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，在國(guó)內(nèi)首次提出增齡導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的理論，并通過(guò)對(duì)模型動(dòng)物用藥顯效證實(shí)了其理論的正確性〔12，13〕。

皮下注射D-半乳糖造成亞急性衰老模型與高脂飼料加維生素D3致AS模型組合，并與進(jìn)行單項(xiàng)干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較，可見(jiàn)該復(fù)合模型較單因素造模在各項(xiàng)指標(biāo)上有更加明顯的變化，證實(shí)年齡是影響AS的一個(gè)重要因素。

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