慢性高眼壓致兔視神經(jīng)及視功能的損傷

魏 文 李 運(yùn) 楊曉冉 鞏 磊 (山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院眼科中心，山東 濟(jì)南 25002)

青光眼是嚴(yán)重危害視神經(jīng)視覺(jué)功能的常見(jiàn)的眼病之一，目前臨床主要根據(jù)眼壓、視乳頭的凹陷性萎縮、特征性視野缺損來(lái)進(jìn)行診斷。高眼壓是其最主要的危險(xiǎn)因素，臨床上往往是在視野缺損或視乳頭病理性改變之后才做出明確的診斷和治療，而此時(shí)病程已非早期，而且青光眼視功能損害是不可逆性，因此對(duì)青光眼的早期診斷、及時(shí)治療顯得尤為重要。我們建立慢性高眼壓動(dòng)物模型，通過(guò)觀察眼壓在中度升高的情況下兔的眼底杯/盤(pán)面積比(C/DAR值)、視覺(jué)電生理a，b，Ops波的振幅及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)纖維數(shù)量的病理改變，研究視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和視功能的損傷，為青光眼的早期干預(yù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新西蘭大白兔20只40眼(由山東省農(nóng)科院兔廠提供)，體重在2～2.5 kg，雌雄不限，經(jīng)裂隙燈檢查證實(shí)無(wú)眼前節(jié)病變，測(cè)量眼壓值均在正常范圍內(nèi)。

1.2 慢性高眼壓動(dòng)物模型的建立與分組 5%戊巴比妥鈉1 ml/kg經(jīng)耳緣靜脈推注麻醉，肌肉注射15 mg/kg以維持麻醉。1%地卡因表面麻醉，經(jīng)角鞏膜緣處用1 ml空針做隧道刺入前房，抽取房水0.2 ml后，每只兔隨機(jī)一眼為高眼壓組(20眼)前房?jī)?nèi)注入卡波姆(上海申興制藥廠)0.2 ml，后緩慢拔出空針，穿刺口自動(dòng)封閉。另一眼為正常組(20眼)僅作前房穿刺，不做前房?jī)?nèi)注入卡波姆。

1.3 術(shù)后觀察

1.3.1 眼壓 建模后，每日固定時(shí)間由同一人測(cè)量眼壓，如測(cè)眼壓連續(xù)兩日低于30 mmHg，即行前房?jī)?nèi)重復(fù)注射卡波姆。

1.3.2 眼底照相 分別于建模前及后7、14、21、28 d在全麻下用眼底照相系統(tǒng)(日本TOPCON TRC.50I-X)行眼底照相。照相結(jié)果采用photoshop 7.0軟件計(jì)算C/DAR值。

1.3.3 閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢查方法及條件 分別于建模前及后7、14、21、28 d在全麻下檢查 F-ERG。應(yīng)用 UTASE3000眼電生理儀器(美國(guó)LKC科技公司)，按照國(guó)際臨床視覺(jué)生理電生理學(xué)會(huì)制定的閃光ERG測(cè)試參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)(ISCEV ERG)〔1〕設(shè)置參數(shù)，檢查前充分散瞳，暗適應(yīng)40 min。脫毛，麻醉，固定電極，在暗紅光下將電極固定于兩眼連線(xiàn)中點(diǎn)和同側(cè)耳廓皮膚，分別作為參考電極和接地電極，眼表面麻醉后角膜接觸電極放置于角膜表面。依次記錄第一項(xiàng)暗視視桿細(xì)胞反應(yīng)、第二項(xiàng)暗視視桿細(xì)胞-視錐細(xì)胞混合反應(yīng)、第三項(xiàng)暗視振蕩電位。明適應(yīng)20 min后按上述步驟測(cè)量第四項(xiàng)明視單次閃光視錐細(xì)胞反應(yīng)、第五項(xiàng)明視30 Hz閃爍光視錐細(xì)胞反應(yīng)。取a波、b波、Ops波振幅為觀察指標(biāo)，每次每只眼測(cè)3次取平均值。

1.3.4 取材及病理標(biāo)本制作 分別于術(shù)后7、14、21、28 d隨機(jī)處死5只兔子，12點(diǎn)方位縫線(xiàn)標(biāo)記，完整摘除眼球，自球后1 mm橫斷視神經(jīng)，分別制成眼球及球后4 mm的視神經(jīng)標(biāo)本，置于10%的中性甲醛溶液中固定48 h后，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明、浸蠟，包埋，平行于眼球剖面通過(guò)視神經(jīng)做6 μm連續(xù)切片6～9張，H-E染色，制成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞病理標(biāo)本。視神經(jīng)行橫斷面切片，3 μm連續(xù)切片3張，采用改良髓鞘染色法染色(麗春紅-亮綠染色法)〔2〕，膠原纖維等結(jié)締組織呈綠色，髓鞘及軸突呈紫紅色。

1.3.5 閱片及圖像分析 OlympusBX51顯微鏡下選取視盤(pán)周?chē)? mm內(nèi)的視網(wǎng)膜標(biāo)本〔3〕，置于400倍下進(jìn)行觀察拍照，用10×10目網(wǎng)格(1 mm2)計(jì)算10個(gè)方格中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目，每只眼計(jì)數(shù)3張切片，每張切片取3個(gè)視野，取平均值。視神經(jīng)切片以10×100油鏡細(xì)致觀察，每例在不同位置采集3幅圖片供分析。在Mias圖像分析系統(tǒng)(分析軟件由四川大學(xué)圖像圖形研究所研制)下打開(kāi)圖像，選擇圖像中髓鞘及軸突染色的紫紅色為目標(biāo)顏色，進(jìn)行顏色分割，對(duì)計(jì)算機(jī)誤判的區(qū)域進(jìn)行人工清除。利用“目標(biāo)計(jì)數(shù)”程序自動(dòng)測(cè)量“目標(biāo)數(shù)目”。并以n/mm2表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行配對(duì)資料t檢驗(yàn)及組間兩兩比較的q(Newman-Keuls法)分析。

2 結(jié)果

2.1 眼壓改變 建模后高眼壓組眼壓均大于30 mmHg，兩組建模前比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。兩組建模后各時(shí)間段比較均有顯著性差異(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 眼底照相

2.2.1 眼底照相改變 建模前兔眼底為粉紅色，視乳頭杯盤(pán)比約0.3。高眼壓組建模后7 d，視乳頭凹陷稍有限局性擴(kuò)大。14 d時(shí)視乳頭凹陷擴(kuò)大，顏色變淺，血管出現(xiàn)輕微移位(圖1)。21 d時(shí)視乳頭凹陷明顯擴(kuò)大，乳頭顏色變淺，血管呈明顯的屈膝狀。28 d時(shí)視乳頭視盤(pán)面積明顯擴(kuò)大、色淡，血管明顯屈膝、變細(xì)。對(duì)照組視乳頭形態(tài)無(wú)改變。

2.2.2 C/DAR值改變的比較 兩組建模前及建模后7 d時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);14 d時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，差異越顯著。見(jiàn)表1。

表1 眼壓值和各組C/DAR值比較(mmHg， ± s，n=20)

表1 眼壓值和各組C/DAR值比較(mmHg， ± s，n=20)

7 d 14 d 21 d 28 d高眼壓組 16.38±3.73 33.28±6.07 35.19±8.11 36.75±7.63 34.27±9.82 0.315±0.029 0.385±0.028 0.475±組別 眼壓建模前7 d 14 d 21 d 28 d C/DAR值建模前0.048 0.535±0.042 0.552±0.036正常組 15.81±2.72 16.79±2.91 16.53±3.17 15.86±2.86 17.46±3.39 0.324±0.030 0.319±0.034 0.327±0.039 0.311±0.052 0.320±0.028 P值 －0.01 0.01 0.01 0.01 0.4 0.06 0.04 0.02 0.01

2.3 標(biāo)準(zhǔn)ERG的改變

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)ERG a波振幅改變 兩組建模前及后7，14 d比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，21 d時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)ERG b波振幅改變 兩組b波振幅于建模后7 d出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，差異越明顯。見(jiàn)表3。

表2 兩組a波振幅比較 (μV， ± s，n=20)

表2 兩組a波振幅比較 (μV， ± s，n=20)

時(shí)點(diǎn) 正常組 高眼壓組 P值建模前73.78±14.89 78.25±20.14 ＞0.057 d 78.40±16.11 60.03±16.17 0.3414 d 76.60±5.19 50.01±11.59 0.1521 d 72.20±6.19 38.40±12.24 0.0428 d 77.10±8.76 12.50±7.07 0.01

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)ERG的Ops波振幅改變 兩組Ops總振幅在建模后7 d時(shí)即出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，差異愈明顯。見(jiàn)表4。

2.4 組織病理學(xué)改變

2.4.1 視網(wǎng)膜組織切片觀察 光鏡下兔的正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)所見(jiàn)與人相似，呈明顯的結(jié)構(gòu)分層。外核層細(xì)胞數(shù)最多，有3～5層;內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)較少，有2～4層;節(jié)細(xì)胞為單層，形態(tài)呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核多偏于外側(cè)，細(xì)胞分布均勻、緊密，形態(tài)、大小近似?？梢郧宄乜吹絻?nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層、外叢狀層、外核層等各層次(圖2)。建模后7 d:高眼壓組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列稀疏，數(shù)目較正常組減少29.41%，但仍可見(jiàn)較多正常的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，兩組間節(jié)細(xì)胞數(shù)目比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。視神經(jīng)纖維層明顯變薄，偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)叢狀層水腫明顯，內(nèi)核層細(xì)胞減少，外叢狀層加厚，外核層細(xì)胞層數(shù)減少。14 d:高眼壓組的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞都表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞泡狀死亡，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，剩余神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯異常，主要表現(xiàn)為胞質(zhì)減少，細(xì)胞形態(tài)紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常組下降43.59%(圖2)，兩者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。內(nèi)核層細(xì)胞層幾乎為單層，外叢狀層水腫明顯增厚，空泡連成片;內(nèi)叢狀層及外核層數(shù)減少。21 d:高眼壓組RGCs數(shù)目下降51.19%，且兩者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。神經(jīng)纖維層、視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)叢狀層高度水腫增厚，層次不清，可見(jiàn)較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，外核層細(xì)胞排列稀疏。28 d:高眼壓組幾乎不能見(jiàn)到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(較正常組下降73.77%)，兩組比較有顯著性差異(P＜0.01)。內(nèi)核層細(xì)胞基本消失，外核層細(xì)胞排列更加稀疏。

表3 兩組不同時(shí)間段b波振幅比較(μV， ± s，n=20)

表3 兩組不同時(shí)間段b波振幅比較(μV， ± s，n=20)

與正常組各時(shí)間段內(nèi)比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

正常組建模前 102.7±19.6 110.7±23.1 220.3±19.5 216.5±22.時(shí)點(diǎn) 第一項(xiàng)高眼壓組 正常組第二項(xiàng)高眼壓組 正常組第四項(xiàng)高眼壓組 正常組第五項(xiàng)高眼壓組8 175.1±13.0 168.3±16.1 82.1±8.5 88.0±9.97 d 87.4±11.0 109.7±18.31) 159.3±25.7 199.0±13.61) 126.1±15.1 160.9±13.21) 66.1±15.1 82.1±8.21)14 d 57.6±16.3 98.8±19.61) 121.0±19.6 203.5±18.32) 89.6±10.1 165.1±13.22) 52.0±7.8 85.1±13.22)21 d 44.1±12.9 102.8±11.62) 78.3±21.3 214.1±25.52) 67.7±5.7 171.3±14.02) 40.2±6.3 83.8±5.72)28 d 20.8±14.6 105.0±10.32) 57.6±16.3 198.8±19.62) 42.2±16.3 169.0±14.92) 18.7±3.9 84.0±6.12)

2.4.2 視神經(jīng)軸突光鏡觀察 正常視神經(jīng)橫切面視神經(jīng)纖維排列緊密，纖維間質(zhì)無(wú)水腫和空泡變性，基質(zhì)均勻紅染;神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻，排列整齊。建模后7 d:高眼壓組視神經(jīng)纖維排列稍疏松，數(shù)目減少，纖維間質(zhì)空泡樣變性較多，水腫加重;膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)基本正常，伴輕度紊亂、增生;可見(jiàn)少量條索樣增生。14 d:高眼壓組視神經(jīng)纖維排列紊亂，數(shù)目減少，纖維間質(zhì)融合的空泡樣變性增多，水腫加重;膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞體積大小不一，數(shù)目減少，排列不均勻;可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。21 d:高眼壓組視神經(jīng)纖維排列失去規(guī)律，數(shù)目減少，纖維間質(zhì)空泡樣變性大片融合，水腫進(jìn)一步加重;膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞體積大小不一，數(shù)目繼續(xù)減少;可見(jiàn)大片漩渦狀增生，較多成纖維細(xì)胞。可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。28 d:高眼壓組視神經(jīng)纖維數(shù)目減少?lài)?yán)重減少，大片纖維間質(zhì)空泡樣變性融合及水腫;膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞罕見(jiàn);可見(jiàn)較多團(tuán)狀纖維增生，成纖維細(xì)胞。淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。視神經(jīng)軸突定量圖像分析兩組視神經(jīng)纖維數(shù)目自建模后7 d時(shí)即存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表5。

表4 兩組不同時(shí)間段Ops波振幅比較(μV， ± s，n=20)

表4 兩組不同時(shí)間段Ops波振幅比較(μV， ± s，n=20)

正常組 高眼壓組 P值建模前97.50±9.61 100.25±12.567 d 98.4±16.11 72.09±8.21 0.0214 d 97.6±5.19 63.03±5.71 0.0121 d 96.2±6.19 43.70±8.79 0.0028 d 97.10±8.76 16.65±3.46 0.00

表5 各組視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)/10 mm2)和視神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)(根/1 mm2， ± s，n=20)

表5 各組視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)/10 mm2)和視神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)(根/1 mm2， ± s，n=20)

組別 視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞視神經(jīng)纖維98 845±659.8正常組 336.21±22.56341.12±27.13333.46±32.15318.91±26.2532962±915.2 32885±901.8 33127±878.3 32629±715.2減少率(%) 29.42 43.59 57.19 73.77 52.43 70.41 80.01 97.41 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.017 d 14 d 21 d 28 d高眼壓組 237.31±35.67192.44±40.36142.74±36.38 83.65±44.1316271±1019.39 732±810.0 6597±786.7 d 14 d 21 d 28 d

減少率=100%－高眼壓組剩余視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目/正常對(duì)照組視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目%

圖1 建模前和建模后14 d眼底照相

圖2 正常視網(wǎng)膜和高眼壓14 d神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(×100)

圖3 正常視神經(jīng)和建模后14 d視神經(jīng)軸突(×100)

3 討論

青光眼時(shí)，眼球隨著高眼壓的持續(xù)存在，視網(wǎng)膜缺血缺氧的時(shí)間延長(zhǎng)，節(jié)細(xì)胞缺血受損，其軸突構(gòu)成的視神經(jīng)損傷、變性〔4，5〕。青光眼視功能損害的病理學(xué)基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的進(jìn)行性凋亡及視神經(jīng)纖維的喪失。隨著高眼壓持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，視網(wǎng)膜光感受器的數(shù)量減少，內(nèi)核層、外核層和叢狀層排列發(fā)生紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)纖維缺失的情況更加嚴(yán)重〔6，7〕。本研究病理切片結(jié)果顯示隨著高眼壓狀態(tài)的持續(xù)視網(wǎng)膜變薄，主要表現(xiàn)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)減少、細(xì)胞水腫變形、最終細(xì)胞核固縮，節(jié)細(xì)胞凋亡;視神經(jīng)纖維排列紊亂，間質(zhì)空泡樣變性，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，膠質(zhì)細(xì)胞增生最終凋亡，視神經(jīng)纖維數(shù)目減少率明顯增加。最終內(nèi)核層及外核層也受累及;與他學(xué)者的研究比較基本相同。

隨著高眼壓持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突呈進(jìn)行性的損傷變性，在臨床上表現(xiàn)為C/DAR的擴(kuò)大及視乳頭凹陷性萎縮。本實(shí)驗(yàn)中兔眼底照相可見(jiàn)視乳頭凹陷加深，顏色變淡;盤(pán)沿變窄，變窄區(qū)域不對(duì)稱(chēng);血管移位，甚至屈膝狀。盤(pán)沿是視杯凹陷邊緣與視盤(pán)邊緣之間的環(huán)行區(qū)域，是視盤(pán)內(nèi)相當(dāng)于視神經(jīng)纖維的組織〔8〕，視盤(pán)盤(pán)沿區(qū)域變窄或者形成切跡，是青光眼視盤(pán)形態(tài)學(xué)改變的典型特征，C/DAR是指視杯面積與視盤(pán)面積之比，能在一定程度上反映視神經(jīng)纖維的數(shù)量。建模后高眼壓組C/DAR值隨著高眼壓持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)與正常組C/DAR值比較逐漸增大且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，出現(xiàn)進(jìn)行性的盤(pán)沿組織的丟失，有研究表明在檢查出視野缺損之前，患者可能有多達(dá)40%的視神經(jīng)纖維喪失〔9〕。另有研究認(rèn)為，臨床出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層缺損時(shí)，組織病理學(xué)檢查已有約50%的神經(jīng)纖維缺損，而視野改變又往往晚于眼底神經(jīng)改變約5年〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上兩位學(xué)者研究結(jié)果相似，甚至更嚴(yán)重。因此對(duì)于青光眼的防治，強(qiáng)調(diào)早發(fā)現(xiàn)早治療。

在本研究中F-ERG中Ops波和b波的振幅最為敏感，于建模后7 d開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此時(shí)RGCs減少29.42%，神經(jīng)纖維數(shù)目明顯減少52.43%;a波則晚，在RGCs減少57.19%，視神經(jīng)計(jì)數(shù)下降80.01%時(shí)才出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)改變。F-ERG是視網(wǎng)膜受到光刺激后在角膜記錄到的一組視網(wǎng)膜電位變化。是反映視網(wǎng)膜功能狀態(tài)的敏感指標(biāo)，a波主要反映視網(wǎng)膜外核層光感受器的變化;b波反映視網(wǎng)膜內(nèi)核層的電活動(dòng)，可能來(lái)源于Muller細(xì)胞和雙極細(xì)胞的跨膜電流〔11〕;Ops為疊加在b波上升支的3～5個(gè)小而快有節(jié)律子波的總和，也稱(chēng)為振蕩點(diǎn)位，起源于視網(wǎng)膜內(nèi)核層，是反映視網(wǎng)膜血液循環(huán)情況的一個(gè)敏感的、客觀的、有效的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明持續(xù)性高眼壓通過(guò)視網(wǎng)膜循環(huán)障礙，導(dǎo)致內(nèi)核層功能下降，出現(xiàn)b波和Ops波振幅降低;最終為外核層受累，在21 d時(shí)a波振幅下降，出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他學(xué)者的研究也表明〔12〕:隨著眼球缺血程度的加重，視網(wǎng)膜振蕩電位的振幅逐漸降低，潛伏期也延長(zhǎng)，而且振蕩電位的異常早于眼底視乳頭的改變，對(duì)視網(wǎng)膜病變的早期診斷有重要價(jià)值。魏華〔13〕等對(duì)可疑開(kāi)角型及早期開(kāi)角型青光眼進(jìn)行視覺(jué)電生理檢查，結(jié)果在可疑青光眼組中有20%OPs波出現(xiàn)異常，提示在開(kāi)角型青光眼病人在出現(xiàn)視野改變以前可能存在OPs異常。因此Ops和b波是反映視網(wǎng)膜功能狀態(tài)的一個(gè)較敏感的指標(biāo)，可以作為青光眼在早期診斷一項(xiàng)客觀檢查。

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