腎癌組織中MMP-2、MMP-9及VCAM-1的表達(dá)變化及意義

趙志紅 倪曉辰 仇 煒 張愛莉 (河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011)

腎癌是我國(guó)常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率近年有上升趨勢(shì)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，促進(jìn)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔1〕。MMP-2和MMP-9是MMPs家族成員，能夠水解基底膜成分Ⅳ型膠原，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)參與多種細(xì)胞間的黏附，與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及免疫逃逸有密切關(guān)系?；谏鲜龇肿釉趷盒阅[瘤進(jìn)展中的重要作用，本研究通過(guò)檢測(cè)并比較MMP-2、MMP-9和VCAM-1在腎癌及癌旁腎組織的表達(dá)情況，為腎癌的治療和判斷預(yù)后提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 腎癌患者隨機(jī)取自我院于2009年4月至2010年2月在泌尿外科住院病人48例，其中男37人，女11人，年齡35～82歲，平均年齡(60.9±9.3)歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行治療，經(jīng)腎腫瘤根治性切除術(shù)后病理證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌。所有患者均于術(shù)后取癌及癌旁腎組織。之后快速切取少量置于10%甲醛溶液中固定，其余組織立即投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 兔抗 MMP-9、VCAM-1多克隆抗體，小鼠MMP-2、β-actin單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒及DAB酶底物顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組織化學(xué)方法 采用免疫組化S-P法檢測(cè)，石蠟包埋后切成5 μm厚的切片，脫蠟復(fù)水，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉，依次滴加一抗、二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。光鏡下觀察，MMP-9、MMP-2及VCAM-1表現(xiàn)棕褐色或棕黃色陽(yáng)性顆粒。半定量結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參考許良忠〔2〕等報(bào)道的方法，即染色強(qiáng)弱分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)為:棕褐色3分;棕黃色2分;淡黃色1分;無(wú)著色0分。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù):一個(gè)視野內(nèi)著色細(xì)胞＞75%為4分;51% ～75%為3分;11% ～50%為2分;≤10%計(jì)為1分;陰性為0分。兩項(xiàng)得分乘積，0～3分為陰性表達(dá)“－”;3分以上為陽(yáng)性表達(dá)“+”。

1.4 明膠酶圖分析 稱取約30 mg液氮凍存標(biāo)本裂解后蛋白定量，各組均取20 μg蛋白與5×上樣緩沖液 (0.1 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，20%甘油，0.1% 溴酚藍(lán)，4%SDS) 混勻，上樣于凝膠(含0.2%明膠)加樣孔內(nèi)。4℃條件下恒壓(120 V)電泳2～3 h。電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)2.5%Triton X-100漂洗三次，每次15 min，使明膠酶復(fù)性;棄去漂洗液，加入反應(yīng)緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2)中，于37℃下溫育過(guò)夜，使明膠酶充分水解凝膠中的明膠。之后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色液脫色至出現(xiàn)白色清晰條帶。然后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像并進(jìn)行灰度掃描。

1.5 Western印跡分析 取上述定量后蛋白裂解液20 μg與5×SDS上樣緩沖液(0.1 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，20% 甘油，0.1%溴酚藍(lán)，10% β-巰基乙醇，4%SDS)混勻，煮沸變性后經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。經(jīng)轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、一抗及二抗孵育和化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)β-actin的表達(dá)水平以作為上述明膠酶圖的內(nèi)參照，使用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描其灰度值。

2 結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，腎癌組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，缺乏典型腎小管、腎小球等結(jié)構(gòu)，MMP-2、MMP-9及VCAM-1陽(yáng)性顆粒均呈典型的棕褐色顆粒，而癌旁組織則僅有散在的棕褐色顆粒 (圖1)。MMP-2，MMP-9及VCAM-1免疫組化結(jié)果表明MMP-2、MMP-9及 VCAM-1在腎癌組織中表達(dá)升高 (P＜0.01) (表1)。明膠酶圖結(jié)果顯示，腎癌組織中MMP-2及MMP-9的明膠酶活性較癌旁組織明顯升高 (P＜0.01)(圖2，表1)。因此上述結(jié)果提示，MMP-2、MMP-9及VCAM-1在腎癌組織中表達(dá)水平增強(qiáng)，這些分子可能在腎癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。

圖1 腎癌組織及癌旁組織中MMP-2、MMP-9及VCAM-1的表達(dá)變化(DAB，×100)

圖2 MMP-2及MMP-9在腎癌及癌旁組織的活性變化(明膠酶圖分析)

表1 MMP-2、MMP-9及VCAM-1在腎癌及癌旁組織中表達(dá)差異比較(n=48)

3 討論

腎癌的組織類型包括透明細(xì)胞癌、乳頭狀腺癌、嫌色細(xì)胞癌、未分化癌等，其中透明細(xì)胞癌最為多見。腫瘤的浸潤(rùn)、侵襲及轉(zhuǎn)移能力是惡性程度的生物學(xué)基礎(chǔ)。在腫瘤的浸潤(rùn)侵襲過(guò)程中涉及多種細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞分泌成分的相互作用。MMP-2及MMP-9是兩種常見的ECM水解酶類，它們可以通過(guò)水解基底膜成分促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲，因此它們是兩種遷移相關(guān)蛋白，與腫瘤細(xì)胞的侵襲性有關(guān)。以往研究表明，MMP-2及MMP-9在多種腫瘤組織中高表達(dá)〔2～5〕，但這些研究主要通過(guò)免疫組織化學(xué)或Western印跡的方法對(duì)MMPs的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。本研究中采用靈敏度高、價(jià)格低廉的明膠酶圖法進(jìn)行檢測(cè)，因此可以直接反映出腎癌組織中MMP-2及MMP-9的明膠酶活性。結(jié)果表明MMP-2及MMP-9活性的增高可能與腎癌的發(fā)病及惡性化密切相關(guān)。VCAM-1是一種細(xì)胞表面黏附分子，它是介導(dǎo)腫瘤免疫的重要分子〔6〕。本文結(jié)果顯示，VCAM-1在腎癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率明顯增加，因此推斷VCAM-1的高表達(dá)與腎癌也有密切聯(lián)系。

惡性腫瘤的個(gè)體化治療是今后治療手段改進(jìn)的新趨勢(shì)。檢測(cè)每個(gè)病例腫瘤細(xì)胞特殊蛋白的表達(dá)譜對(duì)于評(píng)估疾病的特點(diǎn)及制定個(gè)體化治療策略具有重要意義。對(duì)于腎癌組織中高表達(dá)某些特征性蛋白的患者，則可以通過(guò)藥物或其他措施抑制這些特征性蛋白的表達(dá)以達(dá)到更好的治療效果。因此，方便高效的檢測(cè)手段是今后個(gè)體化治療方案制定的前提。對(duì)于高表達(dá)上述腫瘤相關(guān)蛋白的患者，在術(shù)后應(yīng)用藥物干預(yù)這些蛋白的表達(dá)水平可能是降低腫瘤復(fù)發(fā)、延長(zhǎng)患者生存率的有效手段。

1 Brassart B，Randoux A，Hornebeck W，et al.Regulation of matrix metalloproteinase-2(gelatinase A，MMP-2)，membrane-type matrix metalloproteinase-1(MT1-MMP) and tissue inhibitor of metalloproteinases-2(TIMP-2)expression by elastin-derived peptides in human HT-1080 fibrosarcoma cell line〔J〕.Clin Exp Metastasis，1998;16:489-500.

2 許良忠，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)〔J〕.中國(guó)癌癥雜志，1996;6:229-31.

3 Liu Z，Li L，Yang Z，et al.Increased expression of MMP-9 is correlated with poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma〔J〕.BMC Cancer，2010;10:270.

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5 Alshenawy HA.Immunohistochemical expression of epidermal growth factor receptor，E-cadherin，and matrix metalloproteinase-9 in ovarian epithelial cancer and relation to patient deaths〔J〕.Ann Diagn Pathol，2010;14:387-95.

6 Wu TC.The role of vascular cell adhesion molecule-1 in tumor immune evasion〔J〕.Cancer Res，2007;67:6003-6.