用于酶熱傳感器的酶標(biāo)甲胺磷農(nóng)藥的低溫貯存研究

Nguyen Van-luc 徐 斐 于勁松 華澤釗

(上海理工大學(xué)低溫與食品冷凍研究所 上海 200093)

作為廣譜高效的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，甲胺磷(Methamidophos，MTD)曾廣泛用于世界各地。由于其對(duì)哺乳動(dòng)物的高毒性以及其長(zhǎng)期殘留性，近年來(lái)國(guó)家對(duì)于甲胺磷的使用有嚴(yán)格的限制，甚至禁止使用于蔬菜及水果種植中。但是由于違禁使用甲胺磷而導(dǎo)致的安全事件仍時(shí)有發(fā)生，因此很有必要建立適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的快速、便捷的檢測(cè)方法[1]。

目前，農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)主要基于酶抑制或免疫分析原理，結(jié)合光度法，以吸光度值作為指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定固定于載體上的殘余酶活性或標(biāo)記在抗體上的酶活性來(lái)間接衡量農(nóng)藥的殘留量[2]。然而，這類光學(xué)檢測(cè)易受電化學(xué)物質(zhì)和光學(xué)物質(zhì)(如樣品顏色)的干擾，造成檢測(cè)結(jié)果的誤差[3]。量熱方法可以克服光學(xué)方法的不足，且有通用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。但是，酶抑制法中酶與底物的反應(yīng)放熱量很小，測(cè)量困難；而免疫分析法中的氧化還原酶類的放熱量雖然較大，但是制備單克隆抗體的成本較高[4]。因此，參考以上兩種方法，基于酯酶-農(nóng)藥抑制劑之間的結(jié)合和免疫學(xué)中的抗體-抗原結(jié)合都是特異性結(jié)合這一原理，將酯酶看作抗體，將農(nóng)藥看作抗原，利用葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOx)等氧化還原酶來(lái)標(biāo)記農(nóng)藥，制得酶標(biāo)農(nóng)藥，并使酶標(biāo)農(nóng)藥與待測(cè)農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)性地與酯酶發(fā)生抑制結(jié)合反應(yīng)(見(jiàn)圖1所示)，通過(guò)檢測(cè)氧化還原酶類反應(yīng)體系獲得較大的反應(yīng)熱，從而采用量熱方法來(lái)快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留。

具有一定活力穩(wěn)定性的酶標(biāo)農(nóng)藥是下一步進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)的必要基礎(chǔ)，但眾多研究表明，具有生物活性的酶，其活性在貯存過(guò)程中降低是不可避免的。這種活性降低速率與包括溫度在內(nèi)的外界條件控制有關(guān)，而運(yùn)用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑和低溫條件可以有效地延長(zhǎng)不同生物活性材料的活性保存期[5-12]。采用加速實(shí)驗(yàn)中獲得的較優(yōu)保護(hù)劑配方對(duì)酶標(biāo)甲胺磷的低溫貯存進(jìn)行了研究，考察了60℃、30℃、4℃和-18℃下保護(hù)劑對(duì)酶標(biāo)農(nóng)藥酶活力的保護(hù)效果，并通過(guò)化學(xué)動(dòng)力學(xué)(Arrhenius方程)的方法對(duì)酶標(biāo)農(nóng)藥在-18℃的貯存期進(jìn)行預(yù)測(cè)，并進(jìn)行-18℃貯存條件下的實(shí)際貯存實(shí)驗(yàn)。

圖1 量熱式農(nóng)藥殘留生物傳感器的檢測(cè)原理Fig.1 Detection principle of thermal pesticide residue biosensor

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲胺磷 (Methamidophos，MTD) 99.0%，分析純，購(gòu)買(mǎi)于上海市農(nóng)藥研究所；2, 4, 6-三硝基苯磺酸 (TNBSA)、丁二酸酐(99%)、葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4, GOx)、辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，分析純，購(gòu)買(mǎi)于Sigma-Aldric公司；NaCl、K2SO4、CaCl2(AR)，購(gòu)買(mǎi)于上海國(guó)藥試劑有限公司; 甘油、木糖醇、半乳糖(純度≥99%)：購(gòu)買(mǎi)于上海楷洋生物技術(shù)有限公司。

UV1700紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；SHZ-88臺(tái)式水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；S22-2定時(shí)恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器廠；SH-DpH計(jì)，上海華光儀器儀表廠；AB204-N分析天平，梅特勒-托利多; THD-4006低溫恒溫循環(huán)器(-40℃～100℃)，寧波天恒儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 酶標(biāo)甲胺磷農(nóng)藥的制備

酶標(biāo)物用TNBSA比色法測(cè)定酶標(biāo)偶聯(lián)結(jié)合比[14-15]，使用的酶標(biāo)物的甲胺磷與葡萄糖氧化酶偶聯(lián)摩爾比測(cè)得為5:1。

1.2.2 酶標(biāo)活力測(cè)定方法及酶標(biāo)活力保留率的計(jì)算

采用分光光度法測(cè)定酶標(biāo)農(nóng)藥上的GOx活力[16]。

在酶活力測(cè)定時(shí)，先分別加入0.21mM的3,3-二甲氧基聯(lián)苯胺鹽2.4mL，10%的(w/v)D-葡萄糖0.5mL，辣根過(guò)氧化物酶溶液(6U/mL) 0.1mL，最后加0.1mL酶標(biāo)農(nóng)藥，空白用0.1mL蒸餾水代替酶標(biāo)農(nóng)藥。將上述試劑混勻后，置于35℃水浴中, 在波長(zhǎng)500nm處測(cè)定吸光度值，每隔30s記錄一次吸光度(Abs), 共記錄5min。酶標(biāo)農(nóng)藥中酶活力按公式(2)計(jì)算：

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖，其中：ΔAbs為斜率，3.1為反應(yīng)總體積；df為稀釋倍數(shù)；7.5為衰減系數(shù)；0.1為酶添加量，U為酶活力單位：在特定條件下，1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1微摩爾底物，或者底物中1微摩爾有關(guān)基團(tuán)所需的酶量，稱為一個(gè)國(guó)際單位(IU，又稱U)。

將配好保護(hù)劑的溶液溶解酶標(biāo)液到一定的濃度，置于60℃下保溫1h，立即取出冷卻到4℃，測(cè)定保溫前后的酶標(biāo)酶活力。按下式計(jì)算，以未添加保護(hù)劑的酶標(biāo)活力保留率為對(duì)照。

(3) 當(dāng)同步的上一層時(shí)鐘設(shè)備是雙套的情況下，如果相互之間偏差超過(guò)50 ms，那么必須停止其中一臺(tái)時(shí)鐘設(shè)備提供時(shí)鐘源，以免影響下一層設(shè)備時(shí)鐘同步。

1.2.3 酶標(biāo)農(nóng)藥的加速貯存實(shí)驗(yàn)

通過(guò)高溫加速實(shí)驗(yàn)，首先篩選出較優(yōu)的保護(hù)劑，然后進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，篩選出最佳的復(fù)合保護(hù)劑配方；獲得最佳的復(fù)合保護(hù)劑配方之后，向酶標(biāo)農(nóng)藥中加入最佳的復(fù)合保護(hù)劑，以未加最佳的復(fù)合保護(hù)劑的酶標(biāo)農(nóng)藥作對(duì)照，分別在不同溫度(60℃、30℃和4℃)條件下進(jìn)行加速貯存實(shí)驗(yàn)。隔一段時(shí)間進(jìn)行一次酶標(biāo)活力測(cè)定，從而得到酶標(biāo)農(nóng)藥在加速實(shí)驗(yàn)條件下的酶活力變化曲線，之后采用化學(xué)動(dòng)力學(xué)(Arrhenius方程)的方法對(duì)酶標(biāo)農(nóng)藥在低溫條件下的貯存情況進(jìn)行理論估計(jì)。

1.2.4 酶標(biāo)農(nóng)藥的低溫貯存實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證加速實(shí)驗(yàn)對(duì)低溫條件下的理論計(jì)算結(jié)果，進(jìn)行酶標(biāo)在-18℃貯存條件下加保護(hù)劑和未加保護(hù)劑時(shí)的實(shí)際貯存實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Minitab v.16 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑篩選的加速實(shí)驗(yàn)

用pH=7.4的PBS溶液配制一定濃度的氯化鈉、硫酸鉀、氯化鈣、木糖醇、半乳糖醇、甘油保護(hù)劑，按上述方法分別測(cè)定保存后酶標(biāo)的酶活保留率，結(jié)果如表1。

表1 不同保護(hù)劑對(duì)酶標(biāo)農(nóng)藥酶活穩(wěn)定性的影響Tab.1 Effect of different protective agents on the stability of enzyme activity of pesticides

從表1中可見(jiàn)，氯化鈉、硫酸鉀、氯化鈣三者相比，只有氯化鈣對(duì)酶標(biāo)的穩(wěn)定性提高沒(méi)有明顯作用，而氯化鈉、硫酸鉀對(duì)酶標(biāo)的酶活穩(wěn)定性保留都有較好的效果，酶標(biāo)酶活力保留率分別為91.08%和82.65%。氯化鈉對(duì)酶標(biāo)穩(wěn)定性的提高主要依賴于電荷中和，硫酸鉀對(duì)酶標(biāo)穩(wěn)定性的提高主要加強(qiáng)疏水相互作用與使全酶二聚體結(jié)構(gòu)更緊湊[7]。三種多元醇， 除了半乳糖醇以外，木糖醇與甘油對(duì)酶標(biāo)的酶活穩(wěn)定性保留較好的效果。酶標(biāo)農(nóng)藥中加入4.0mol/L的木糖醇，60℃下1h處理后的酶活保留率為83.69%，比未加保護(hù)劑的高出22.59%。在1.0mol/L甘油的濃度中，60℃條件下保存1h后的酶活保留率為86.04%，比未加保護(hù)劑的高出24.94%。由表1可見(jiàn)，氯化鈉、木糖醇、甘油對(duì)酶標(biāo)農(nóng)藥酶活保存的效果最佳。根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，氯化鈉、木糖醇、甘油是較好的保護(hù)劑，在此基礎(chǔ)上通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化復(fù)合保護(hù)劑濃度，以發(fā)揮各保護(hù)劑之間的協(xié)同作用，進(jìn)一步提高酶標(biāo)的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)選用L9(33)，選取的因素、水平和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 復(fù)合保護(hù)劑的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental design and results of composite protective agents

通過(guò)Minitab v.16 對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析表明，氯化鈉對(duì)酶標(biāo)穩(wěn)定性的影響最大，其次為甘油，木糖醇對(duì)酶標(biāo)酶活保留率的影響較小，復(fù)合保護(hù)劑的最佳配方為A2B2C3：用2.0mol/L氯化鈉、4.0mol/L木糖醇、1.25mol/L甘油組成的復(fù)合保護(hù)劑經(jīng)60℃保存1h后酶標(biāo)酶活保留率達(dá)96.30%，比未加保護(hù)劑的高出35.20%。

2.2 酶標(biāo)農(nóng)藥低溫貯存期的理論預(yù)測(cè)

基于最佳的復(fù)合保護(hù)劑配方，首先考察了酶標(biāo)農(nóng)藥(加保護(hù)劑和未加保護(hù)劑)在不同溫度條件下(60℃、30℃和4℃)酶活力隨溫度的變化情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶標(biāo)農(nóng)藥在不同溫度貯存時(shí)酶活力的變化Fig.2 Enzyme activity changes of enzyme-labeled pesticides at different temperatures

酶標(biāo)農(nóng)藥的酶活穩(wěn)定性，除了自身的特點(diǎn)以外，主要與保存狀態(tài)有關(guān)。酶的活性降低可認(rèn)為是一種特殊形式的蛋白質(zhì)變性反應(yīng)。該變性作用常遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，所以酶活性與貯存時(shí)間關(guān)系可用以下關(guān)系式描述[17]：

式中，Er為殘留酶活性，Eo為初始酶活性，t為貯存時(shí)間(h)，k為該溫度下酶活降低的速率常數(shù)?？梢?jiàn)，殘留酶活變化的快慢由k決定。相同時(shí)間內(nèi)，酶活殘存率的對(duì)數(shù)與k呈負(fù)線性關(guān)系。k本身是一個(gè)受多種因素影響的常數(shù)。其他條件不變情況下，k值與貯存溫度T應(yīng)符合Arrhenius關(guān)系，即：

式中，R是通用氣體常數(shù)，E是活化能(Activation energy)，A則稱為Arrhenius因子，對(duì)于給定的反應(yīng)，A是個(gè)常數(shù)。從貯存角度說(shuō)，貯存介質(zhì)條件是影響E和A的主要因素。許多酶反應(yīng)速率、心搏速率、呼吸速率、變質(zhì)反應(yīng)速率等都符合Arrhenius關(guān)系[18]。

根據(jù)一般推薦的活化能E的數(shù)值，可以算出反應(yīng)速率k隨溫度降低而衰減的情況。按此也可以得到生物活性殘留受溫度影響的關(guān)系。比如，若一生物體在4℃環(huán)境下能存活2h，那么按理論，它在-40℃能存活數(shù)日，在-80℃可以存活數(shù)月，而在-196℃(液氮溫度)可望保存幾個(gè)世紀(jì)[19]。

依據(jù)化學(xué)動(dòng)力學(xué)的原理，基于圖2中各個(gè)曲線的相關(guān)方程，得到各個(gè)溫度條件下的酶活損失速率(表3)。從表3可見(jiàn)，溫度較高時(shí)，酶標(biāo)農(nóng)藥的酶活損失速率是比較快的，隨著溫度的降低，其酶活的損失速率迅速降低。低溫貯存是有效保持酶標(biāo)農(nóng)藥中的酶活力的重要手段。

表3 各溫度下的酶活損失速率Tab.3 Enzyme activity loss rate at differernt temperature

根據(jù)Arrhenius方程，lnk和1/T應(yīng)呈簡(jiǎn)單的直線關(guān)系。按表3作圖得到圖3，經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)：lnk和1/T之間的線性關(guān)系較好，且加或未加保護(hù)劑兩條曲線的斜率較一致，說(shuō)明加或未加保護(hù)劑對(duì)酶活損失的溫度敏感性沒(méi)有明顯的影響。Arrhenius方程是進(jìn)行單因子加速實(shí)驗(yàn)時(shí)最常用的動(dòng)力學(xué)模型[20]。一般加速實(shí)驗(yàn)要選擇在盡量高的溫度下實(shí)施，以便在短時(shí)間內(nèi)外推得到低溫下的速率數(shù)據(jù)。外推結(jié)果的準(zhǔn)確性與Arrhenius方程的適用溫度范圍密切相關(guān)。如果在加速高溫與外推低溫之間，食品發(fā)生相變、玻璃化轉(zhuǎn)變等，其品質(zhì)衰敗的機(jī)理可能改變，高溫實(shí)驗(yàn)得到的動(dòng)力學(xué)參數(shù)在低溫下不再適用，則外推結(jié)果的潛在誤差很大。因此，在進(jìn)行加速實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，合理選擇加速溫度就非常重要。研究的貯藏溫度范圍較寬，跨越相變點(diǎn)，利用Arrhenius方程進(jìn)行外推時(shí)，應(yīng)該非常慎重，應(yīng)借助實(shí)際貯存實(shí)驗(yàn)對(duì)外推的理論計(jì)算準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)圖3，在進(jìn)行低溫貯存實(shí)驗(yàn)之前，對(duì)酶標(biāo)農(nóng)藥在低溫條件下的貯存情況進(jìn)行了外推的理論計(jì)算。根據(jù)Arrenius方程(圖3)， 理論計(jì)算得到：-18℃時(shí)酶活的損失速率常數(shù)k分別為4.99E-05(未加保護(hù)劑)和4.34E-06(加保護(hù)劑)；貯存2周后，酶標(biāo)農(nóng)藥酶活保留率分別為98.34%(未加保護(hù)劑)和99.85%(加保護(hù)劑)；6個(gè)月后，酶活保留率分別為80.59%(未加保護(hù)劑)和98.14%(加保護(hù)劑)；12個(gè)月后，酶標(biāo)保留率為64.95%(未加保護(hù)劑)和96.31%(加保護(hù)劑)。

圖3 Arrenius方程圖Fig.3 Arrenius equation graph

2.3 酶標(biāo)農(nóng)藥低溫貯存的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證上面的理論計(jì)算結(jié)果，進(jìn)行了酶標(biāo)在-18℃貯存條件下的實(shí)際貯存實(shí)驗(yàn)，其酶活力的變化如表4所示。根據(jù)-18℃條件下酶標(biāo)的酶活力變化情況，得到其酶活損失速率常數(shù)k為：6.00E-05(未加保護(hù)劑)和6.00E-06(加保護(hù)劑)，酶活損失速率常數(shù)是理論計(jì)算的1.2024倍(未加保護(hù)劑)和1.3824(加保護(hù)劑)倍(表5)。與外推的理論計(jì)算相比，在-18℃貯存條件下實(shí)際保存2周后酶活的保留率為97.98%(未加保護(hù)劑)，99.79%(加保護(hù)劑)；貯存6個(gè)月后，酶標(biāo)農(nóng)藥酶活保留率為77.13%(未加保護(hù)劑)，97.44%(加保護(hù)劑)。實(shí)際測(cè)試時(shí)酶活的保留率與理論計(jì)算相比，貯存2周后未加保護(hù)劑時(shí)其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.59%，加保護(hù)劑時(shí)0.04%；貯存6個(gè)月后未加保護(hù)劑時(shí)其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.10%，加保護(hù)劑時(shí)0.51%。這一結(jié)果將為下一步的農(nóng)殘檢測(cè)酶熱傳感器的開(kāi)發(fā)提供必要的基礎(chǔ)。

表4 酶標(biāo)農(nóng)藥在-18℃貯存時(shí)的酶活力變化Tab.4 Enzyme activity changes of enzyme-labeled pesticides at -18℃

表5 實(shí)際驗(yàn)證與理論計(jì)算的k值對(duì)比Tab.5 k-value contrast between the actual veri fi cation and the theoretical

3 結(jié)論

為了提高葡萄糖氧化酶酶標(biāo)甲胺磷農(nóng)藥的穩(wěn)定性，采用加速實(shí)驗(yàn)獲得了較優(yōu)保護(hù)劑配方(2.0 mol/L氯化鈉、4.0mol/L木糖醇、1.25mol/L甘油)，對(duì)酶熱傳感器中酶標(biāo)甲胺磷農(nóng)藥低溫貯存過(guò)程中的酶活變化進(jìn)行了研究，結(jié)論如下：酶標(biāo)農(nóng)藥低溫貯存期的理論預(yù)測(cè)顯示：酶標(biāo)農(nóng)藥的貯存溫度與其酶活損失速率常數(shù)之間符合Arrhenius關(guān)系，利用Arrhenius方程可以預(yù)測(cè)酶標(biāo)農(nóng)藥在低溫條件下貯存時(shí)的貯存期；實(shí)際測(cè)試時(shí)，酶活損失速率常數(shù)是理論計(jì)算的1.2024倍(未加保護(hù)劑)和1.3824倍(加保護(hù)劑)；低溫驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在-18℃貯存條件下實(shí)際保存2周后酶活的保留率為97.98%(未加保護(hù)劑)，99.79%(加保護(hù)劑)；貯存6個(gè)月后，酶標(biāo)農(nóng)藥酶活保留率為77.13%(未加保護(hù)劑)，97.44%(加保護(hù)劑)。與理論預(yù)測(cè)相比，在-18℃貯存條件下實(shí)際貯存2周后二者酶活保留率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.59%(未加保護(hù)劑)和0.04%(加保護(hù)劑)；貯存6個(gè)月為3.10%(未加保護(hù)劑)和0.51%(加保護(hù)劑)。這一結(jié)論將為酶標(biāo)甲胺磷農(nóng)藥在農(nóng)藥殘留檢測(cè)生物傳感器開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用打下必要的基礎(chǔ)。

本文受上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目(10391901500)和上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(2006第7- 4號(hào))資助。(The project was supported by the Shanghai Science and Technology Commi ssion(No.10391901500)and Shanghai Agriculture Commission(2006 No.7-4).)

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