禽呼腸病毒感染雞胚成纖維細胞后Toll樣受體mRNA轉錄水平的動態(tài)變化

藍元喜 ,謝芝勛，黃　莉，謝麗基，鄧顯文，范　晴，羅思思，謝志勤，黃嬌玲，張艷芳，王　盛，曾婷婷

(1.廣西大學動物科學技術學院 ，廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室，廣西南寧 530001)

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研究論文

禽呼腸病毒感染雞胚成纖維細胞后Toll樣受體mRNA轉錄水平的動態(tài)變化

藍元喜1,謝芝勛2*，黃莉2，謝麗基2，鄧顯文2，范晴2，羅思思2，謝志勤2，黃嬌玲2，張艷芳2，王盛2，曾婷婷2

(1.廣西大學動物科學技術學院 ，廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室，廣西南寧 530001)

為分析禽呼腸病毒(ARV) 標準毒株S1133株感染雞胚成纖維細胞(CEF)后對相關雞Toll樣受體(ChTLRs)mRNA轉錄水平的影響作用，利用實時熒光定量PCR，測定和分析ARV-S1133感染CEF后ARV結構蛋白σC和ChTLRs的mRNA轉錄水平變化情況。結果表明，ARV-S1133感染CEF 10 h后,ARV σC蛋白的mRNA相對表達量開始迅速上升，在48 h達到峰值；同時，感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21 mRNA表達量發(fā)生顯著變化，在感染72 h內(nèi)各個受體的mRNA表達量呈波浪式變化。5個不同滴度的ARV感染CEF 24 h后，ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21 mRNA轉錄水平與病毒滴度均呈正線性相關。上述結果表明,ARV感染后可誘導CEF ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA轉錄水平發(fā)生變化，可能與禽呼腸病毒的復制和致病機制相關。

禽呼腸病毒；雞Toll樣受體；實時熒光定量PCR；轉錄水平

禽呼腸病毒(Avian reovirus，ARV)屬于呼腸病毒科正呼腸病毒屬成員，主要引起雞病毒性關節(jié)炎/腱鞘炎、矮小綜合征、慢性呼吸道病、免疫抑制性疾病和吸收障礙綜合征等，世界范圍內(nèi)廣泛存在，給全球養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[1-2]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類胚系編碼的模式識別受體，通過識別病原微生物保守的分子相關模式，實現(xiàn)對外來病原體的早期識別，啟動機體的天然免疫和引起獲得性免疫反應，在抗感染免疫和激活獲得性免疫中都發(fā)揮重要作用。目前研究表明，已經(jīng)鑒定的雞Toll樣受體(chicken Toll-like receptors,ChTLRs)已超過10種，包括ChTLR3、ChTLR7、ChTLR21等，其中，ChTLR3能識別病毒dsRNA(呼腸病毒)或poly(I：C)，誘導相關轉錄因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫細胞因子的表達,介導天然免疫應答，進而使宿主抵御病毒的感染[3-4]；ChTLR7主要表達于B細胞、T細胞亞群以及樹突細胞亞群等，可識別單鏈RNA病毒[5]； ChTLR21可以識別具有CpG結構單元的DNA病毒的DNA,可能與雞抵抗病毒入侵有關[6]；ChTLR5主要在宿主防御微生物感染過程中發(fā)揮作用，ChTLR15是家禽中所特有的受體，其在細胞中的位置和配體識別機制尚不清楚[7]。ChTLRs能夠識別入侵機體的外來病原體，其表達量并隨之發(fā)生變化。因此，進行相關的ChTLRs表達水平監(jiān)測，對研究疾病致病機制和機體免疫水平有重要意義。研究表明，禽流感、雞傳染性法氏囊病病毒感染后雞ChTLR3基因的相對表達量發(fā)生明顯變化[3]，還引起免疫器官中ChTLR7 mRNA轉錄水平上調(diào)[5]。馬立克病病毒感染可影響雞淋巴器官Toll樣受體通路基因的表達量[8]。但目前有關ARV感染后ChTLRs在機體免疫反應中的作用研究較少。為了分析ARV感染后病毒與宿主細胞的相互作用以及調(diào)控相關ChTLRs表達情況，本研究利用已建立的ChTLRs實時熒光定量PCR方法檢測ARV-S1133感染后CEF中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的轉錄水平動態(tài)變化[9-11]，為進一步研究ARV的致病機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1種蛋與試劑SPF種蛋，北京梅里亞公司產(chǎn)品；F-12 DMEM， Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清，明海公司產(chǎn)品；RNA提取試劑RNAiso Plus 、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR○RPremix ExTaqTMⅡ寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；2×EasyTaqPCR SuperMix，北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.1.2病毒和細胞禽呼腸病毒標準強毒株S1133株(ARV-S1133)，本實驗室保存。參照《動物病毒學》中[12]CEF制備方法，采用10日齡SPF雞胚制備雞胚成纖維細胞(chicken embryo fibroblast，CEF)。

1.2方法

1.2.1病毒感染將制備好的CEF細胞置于37℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h～36 h長成單層的CEF，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次后，分別接種不同滴度(105、104、103、102、101個TCID50)的ARV-S1133病毒液，37℃孵育1 h，棄病毒液，加入含20 mL/L胎牛血清的DMEM和F-12細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每個滴度設3個重復。同時，設置未感染對照組。

1.2.2收集細胞樣品在1、2、4、6、8、10、12、16、24、36、48、60、72 h 分別收集未感染對照組和105個TCID50ARV-S1133感染細胞。其他滴度ARV感染組和對照組，在感染24 h后收集CEF細胞。收集方法：棄細胞培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2次后,用刮鏟刮取細胞凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細胞總RNA抽提與反轉錄參照RNAiso Plus使用說明書和文獻[13]提取各時間點CEF樣品的總RNA。將總RNA重懸于35.0 μL DEPC水中，加入5×g DNA Eraser buffer、gDNA Eraser，42℃ 作用2 min以去除基因組DNA；再依次加入Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ、RT Primer Mix 4、5×PrimeScript buffer 2、RNase Free dH2O，混勻后于37℃ 15 min，85 ℃ 5 s進行反轉錄。制備好的cDNA于-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4實時熒光定量PCR對試驗樣品的測定根據(jù)本實驗室已建立的雞ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21和GAPDH，及ARV-σC基因的實時熒光定量PCR檢測方法[9-11]，用羅氏lightcycle2.0實時熒光定量PCR儀檢測細胞樣品中各受體基因的表達情況，每份cDNA樣品設3個重復。

1.2.5數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析經(jīng)real-time PCR反應后,獲得目的基因和看家基因GAPDH的Ct值。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算各目的基因在不同時間點的相對表達量，并用Student t2方法進行統(tǒng)計分析。顯著性差異分析水平為P<0.05，極顯著性差異分析水平為P<0.01[14]。

2　結果

2.1ARV結構蛋白σС基因mRNA的轉錄水平變化

首先，為了明確ARV在CEF中的感染情況，檢測ARV結構蛋白σС的mRNA轉錄水平(圖1)。自ARV感染CEF后，ARV結構蛋白σСmRNA的相對表達量，在感染早期檢測到σСmRNA的表達量， 10 h起快速上調(diào)，至48 h時顯著升高且達到峰值，隨后因細胞死亡脫落，ARV-σСmRNA的相對表達量下降。

圖1　不同時相的ARV-σС基因mRNA的轉錄變化Fig.1　The levels of ARV-σС mRNA transcription in different timeafter ARV-s1133 infection

2.2ARV-S1133株感染CEF后ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的轉錄水平變化

105個TCID50的ARV-S1133株感染CEF后，ARV S1133株對CEF中ChTLRs轉錄水平的影響見圖2。結果顯示，與對照組相比，ARV-S1133株感染后，ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21mRNA在感染早期迅速表達上調(diào)，在整個細胞感染過程中呈波浪式變化。ChTLR3 mRNA在感染后1 h表達量略高于對照組，2 h表達量差異顯著，6 h顯著降低，隨后12 h和24 h表達量顯著升高且達到峰值(P<0.05)。ChTLR5 mRNA表達量在感染后1 h稍低于對照組，在10 h ChTLR5 mRNA的表達量極顯著升高并達到峰值，隨后24 h表達量顯著升高，72 h表達量極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。ChTLR7 mRNA在感染1 h后表達量開始上調(diào)，6 h表達量顯著升高并達到峰值，隨后12 h表達量極顯著低于對照組，但24 h顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)。ChTLR15 m在感染后1 h表達量略高于對照組，4 h表達量顯著升高并達到峰值，感染后12 h表達量極顯著升高并達到峰值(P<0.05或P<0.01)達到峰值。ChTLR21 mRNA在感染后1 h表達量顯著低于對照組， 2 h表達量差異顯著上升，10 h表達量極顯著上升并達到峰值，隨后36 h ChTLR21 mRNA表達量顯著上升并達峰值(P<0.05或P<0.01 )，其余時間點表達量變化不明顯。

2.3不同滴度ARV感染24 h后ChTLRs的測定

為了研究ChTLRs的mRNA的表達量是否與ARV的感染滴度高低有關，real-time PCR檢測了不同滴度的ARV感染CEF中ChTLRs的轉錄水平變化。結果見圖3，結果表明所檢測的這5種ChTLRs的表達量與感染ARV的毒價均呈正相關關系。

A.ChTLR3;B.ChTLR5;C.ChTLR7;D.ChTLR15;E.ChTLR21

圖2CEF感染ARV后雞Toll樣受體(TLR3、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21)基因mRNA的動態(tài)轉錄水平

Fig.2Dynamics of the transcription of ChTLR3，ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15 and ChTLR21 genes in CEF after ARV infection

A.ChTLR3;B.ChTLR5;C.ChTLR7;D.ChTLR15;E.ChTLR21

圖3不同毒價ARV感染 CEF 24 h 后雞Toll樣受體mRNA的轉錄變化

Fig.3The transcriptional profiles of Toll-like receptor mRNA in CEF after 24 h of infection with different doses of ARV

3　討論

本試驗利用real-time PCR檢測了ARV感染72 h內(nèi)各個時間點CEF中ChTLRs和ARV結構蛋白σС mRNA轉錄水平的變化，結果發(fā)現(xiàn),ARV-σС在整個試驗過程中均能檢測到σС的表達，感染早期表達量較低，自10 h開始迅速升高,至48 h達到峰值。而所檢測ChTLRs在ARV感染72 h內(nèi)各個時間點CEF中表達量各有不同，其中ChTLR(3、5、7、15、21)5個受體表達量在不同試驗時間點發(fā)生顯著變化。

ChTLR3能識別雙鏈RNA病毒，ARV感染CEF發(fā)現(xiàn)在感染早期上調(diào)，隨著ARV增殖，ChTLR3 mRNA表達下降，但在感染后期，ChTLR3 mRNA表達量上升于24 h達到峰值。這與施蕾等高[3]通過用IBDV感染CEF結果發(fā)現(xiàn)ChTLR3在感染24 h后表達水平有明顯增高相似。ChTLR5在宿主防御微生物感染過程中發(fā)揮作用，在ARV感染CEF 10 h升高達到峰值，感染ARV 10 h后，隨著ARV的增殖ChTLR5表達量下降，48 h后ARV的下降，ChTLR5表達量又開始上調(diào)。ChTLR7可識別單鏈RNA病毒，表達量在ARV感染初期達到峰值，10 h后表達量被下調(diào)，在感染12 h下調(diào)至最低谷值，隨后在24 h又上調(diào)，與弓莉等[5]IBDV感染引起免疫器官中TLR7 mRNA轉錄上調(diào)相似。ChTLR15為家禽特有的受體，其在細胞中的位置和配體識別機制尚未清楚，本試驗中ChTLR15 mRNA表達量在ARV感染早期上調(diào)，在12 h顯著升高并達到峰值，隨后表達量變化不大，這與郭新鳳等[14]IBDV感染早期上調(diào)法氏囊和外周血單核細胞ChTLR3/4/15 mRNA的 表達相似，ChTLR21可CpG結構單元的DNA病毒，本試驗中ChTLR21 mRNA表達量在ARV感染早期迅速上調(diào)，10 h達到峰值，隨后表達量下降，表達趨勢與ARV-σС的表達趨勢相反。

在本研究中，ARV感染組CEF整個過程中均有檢測到ARV結構蛋白σС的表達，感染后期結構蛋白σС增殖趨勢達到峰值，說明ARV已成功感染了CEF; 并且檢測的5個受體ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21 mRNA轉錄水平發(fā)生變化，且不同時間點上調(diào)幅度有所差別，說明這5個ChTLRs可能參與了ARV的致病過程。且在不同滴度病毒感染CEF后5個ChTLRs mRNA轉錄水平與病毒滴度正線性相關，說明了ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的表達可能與病毒的復制相關，但這5個ChTLRs在ARV感染過程的具體作用還有待進一步研究。

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Dynamic Changes of Toll-like Receptor mRNA Transcription Levels in Chicken Embryo Fibroblasts Infected with Avian Reovirus

LAN Yuan-xi1,XIE Zhi-xun2,HUANG Li2,XIE Li-ji2,DENG Xian-wen2,FAN Qing2,LUO Si-si2,XIE Zhi-qin2,HUANG Jiao-ling2,ZHANG Yan-fang2,WANG Sheng2,ZENG Ting-ting2

(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530004,China; 2.Guangxi VeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnostic,Nanning,Guangxi,530001,China)

In order to analyze the mRNA transcriptic changes of chicken Toll-like receptors in ARV standard strain S1133-infected CEF cells,real-time PCR was used to analyze the mRNA transcriptic changes of ARV structural protein σC and chicken Toll-like receptors in ARV S1133-infected CEF cells. The results showed that the relative expression levels of ARV structural protein σC were elevated since 10 h post-infection,reaching a peak at 48 h post-infection.During this period,the mRNA transcriptic levels of ChTLR3,ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15 and ChTLR21 genes were changed significantly in the infected CEF cells with different patterns.Meanwhile,the results of different ARV dose infection assay showed that the mRNA transcriptic levels of ChTLR3,ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15and ChTLR21 genes were positively correlated with the virus doses.These data above suggest that ARV infection could effectively induce the mRNA expression changes of ChTLR3,ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15 and ChTLR21.Furthermore,ChTLR3,ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15 and ChTLR21 may play important roles in replication and pathogenic mechanisms of ARV.

Avian reovirus;chicken Toll-like receptor;real-time PCR;transcription level

2016-03-07

國家自然科學基金項目(31160512)；廣西自然科學基金項目(2014GXNSFCA118006)；廣西特聘專家專項項目(2011B020)；廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技項目(桂漁牧科201452003)

藍元喜(1989-)，男(壯族)，廣西來賓人，碩士研究生，主要從事禽病防治與病原分子生物學研究。*通訊作者

S852.659.4

A

1007-5038(2016)09-0001-05