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    Survivin-siRNA真核重組質(zhì)粒對前列腺癌移植瘤的抑制作用*

    2012-08-02 06:26:42沈維高趙麗晶閆喜惠劉艷波趙雪儉
    中國病理生理雜志 2012年12期
    關(guān)鍵詞:電脈沖陽性細(xì)胞前列腺癌

    郭 鵬, 沈維高, 趙麗晶, 閆喜惠, 劉艷波, 趙雪儉△

    (北華大學(xué)1附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕病科,2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,吉林 吉林 132013;3吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心,吉林 長春 132001)

    凋亡抑制基因survivin是1997年分選出來的一個(gè)新基因。人類survivin基因定位于染色體17q25,長約75~130 kb,含3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子,無TATA啟動(dòng)子結(jié)構(gòu),其編碼鏈包含1個(gè)開放閱讀框架,產(chǎn)生由142個(gè)氨基酸組成的分子量約16.6 kD的胞質(zhì)蛋白[1]。Survivin在大多數(shù)人類腫瘤中均有高表達(dá),前列腺癌也不例外,且與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[2],其表達(dá)強(qiáng)度和前列腺癌細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)[3]。RNA干擾可作為引物使mRNA轉(zhuǎn)變成dsRNA,新生的dsRNA被降解,在消除靶mRNA同時(shí)又產(chǎn)生更多的siRNA,如此循環(huán)[4]。因此siRNA具有特異性、作用效率較高和干擾作用可擴(kuò)散等特點(diǎn),具有很強(qiáng)的抑制目的基因表達(dá)的作用。本課題組前期工作表明,針對survivin靶點(diǎn)的siRNA重組質(zhì)粒體外明顯抑制激素非依賴性前列腺癌DU145細(xì)胞生長并促進(jìn)其凋亡[5],本實(shí)驗(yàn)主要研究survivin-siRNA是否具有體內(nèi)抑瘤效應(yīng),并簡要探討其作用機(jī)制。

    材料和方法

    1 材料

    人激素非依賴性前列腺癌DU145細(xì)胞株,由吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心饋贈(zèng);大腸桿菌JM109為該中心保存;survivin-siRNA及對照質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定按本課題組以前方法[5];DNA純化試劑盒、DNA提取試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品;IMDM培養(yǎng)基為HyClone生產(chǎn),新生牛血清購自北京鼎國公司;兔抗人survivin抗體及羊抗兔Ⅱ抗購自 Santa Cruz,臺(tái)盼藍(lán)購自 Sigma,K-PBS溶液(NaCl 30.8 mmol/L、KCl 20.7 mmol/L、Na2HPO48.1 mmol/L、KH2PO41.46 mmol/L、MgCl210 mmol/L 溶解于雙蒸水)為自制;TUNEL染色試劑盒購自南京建成生物試劑公司;其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純;ECM830電轉(zhuǎn)染儀購自BTX。

    2 動(dòng)物

    裸鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。BALB/c nu/nu雄性裸鼠,15只,4~6周齡,體重18~20 g,飼養(yǎng)于恒定溫度(22~25℃)、恒定濕度(40% ~50%)的SPF層流室中,經(jīng)高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和水供動(dòng)物自由食用。

    3 方法

    3.1 裸鼠動(dòng)物模型的建立及處理 將DU145細(xì)胞用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液,離心,細(xì)胞團(tuán)塊在IMDM培養(yǎng)液中吹散,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞活力≥95%,最終細(xì)胞濃度為2.5×1010cells/L,取5×106個(gè)細(xì)胞(0.2 mL)接種于裸鼠左側(cè)背部皮下。待移植瘤長至直徑8 mm時(shí)將瘤無菌條件下取出,分成直徑約2 mm的瘤塊植入另取的15只裸鼠皮下。質(zhì)粒溶解于K-PBS溶液中,定量,調(diào)節(jié)質(zhì)粒濃度為1 g/L。待移植瘤長至直徑約8 mm時(shí)將裸鼠隨機(jī)分為3組,每組5只動(dòng)物,mock組注射20 μL K-PBS;scrambled siRNA及survivin-siRNA進(jìn)行質(zhì)粒治療(每只20 μg);在注射結(jié)束后于注射局部實(shí)行電轉(zhuǎn)染。電脈沖治療儀的參數(shù)設(shè)定:電場強(qiáng)度500 V/cm,脈沖時(shí)值5 μs,次數(shù)2次,頻率1 Hz。兩排銀電極插入腫瘤組織兩側(cè),使腫瘤位于電極中央。10 d后重復(fù)注射質(zhì)粒1次。

    3.2 腫瘤觀察及測量 每天觀察裸鼠各種生活變化,每隔5 d測量腫瘤的長徑(length,L)和短徑(width,W),根據(jù)公式 V=L×W2×0.52計(jì)算腫瘤的體積,繪制腫瘤的生長曲線并計(jì)算抑瘤率(inhibitory rate,IR),IR(%)=(1-治療組瘤重/對照組瘤重)×100%。

    3.3 腫瘤標(biāo)本處理 在初次電轉(zhuǎn)染25 d后頸椎脫臼處死裸鼠,迅速剪開皮膚,完整剝離腫塊,稱重,部分組織甲醛溶液固定。

    3.4 病理學(xué)檢查 取10%甲醛固定后的組織,石蠟包埋,4 μm連續(xù)切片分別行HE染色和survivin免疫組織化學(xué)染色。每張切片觀察3個(gè)視野,每個(gè)視野連續(xù)數(shù)300個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞百分比=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。結(jié)果判定:survivin在腫瘤細(xì)胞胞漿或細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒,且著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽性。

    3.5 TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡 切片常規(guī)脫蠟入水,新鮮配制的3%H2O2室溫處理10 min,蒸餾水洗2 min×3次。標(biāo)本用proteinase K 37℃消化15 min,加標(biāo)記緩沖液,每片20 μL;然后加稀釋的 TdT和DIG-dUTP混合液,37℃孵育2 h。TBS洗2 min×3次。加封閉液每片 50 μL,室溫 30 min,不洗。再加入生物素化抗地高辛抗體于標(biāo)本片上,37℃反應(yīng)30 min。TBS洗2 min×3次。加稀釋的SABC染色60 min,TBS洗5 min×3次。DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察。

    細(xì)胞核染為棕黃色者即為凋亡細(xì)胞,每張切片觀察3個(gè)視野,每個(gè)視野連續(xù)數(shù)300個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞百分比即為凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)。AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 腫瘤體積監(jiān)測

    裸鼠背部皮下注射DU145細(xì)胞后可成功復(fù)制出荷瘤動(dòng)物模型,然后將腫瘤組織取下,分成約2 mm×2 mm×2 mm小塊接種背部,待移植瘤長至直徑約8 mm,平均體積約(161.5±14.4)mm3時(shí),隨機(jī)分為3組,每組5只動(dòng)物,并進(jìn)行治療,10 d后重復(fù)給藥1次。從種植瘤塊當(dāng)天開始連續(xù)觀察腫瘤的生長情況,并繪制各組裸鼠腫瘤的生長曲線圖,見圖1。與mock組及scrambled siRNA組相比,survivin-siRNA治療組動(dòng)物移植瘤生長較緩慢,初次治療后15 d,腫瘤體積明顯縮小(P<0.05);且隨時(shí)間延長,治療組動(dòng)物腫瘤生長顯著減慢(P<0.01)。于初次電轉(zhuǎn)染25 d(即瘤塊接種后35 d)處死動(dòng)物取移植瘤稱重,與兩對照組相比,治療組移植瘤重量明顯減輕(P<0.01),見表 1。

    Figure1.Growth curves of DU145 xenografts treated with survivin-siRNA.Each treatment with the plasmid is shown using an arrow..n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs mock or scrambled siRNA.圖1 Survivin-siRNA對裸鼠腫瘤生長曲線的影響

    表1 Survivin-siRNA對前列腺癌移植瘤重量的影響Table1.The effect of survivin-siRNA on xenograft weight(g..n=5)

    表1 Survivin-siRNA對前列腺癌移植瘤重量的影響Table1.The effect of survivin-siRNA on xenograft weight(g..n=5)

    **P <0.01 vs mock or scrambled siRNA.

    Group Weight Mock 1.64 ±0.46 Scrambled siRNA 1.67 ±0.33 Survivin-siRNA 0.62 ±0.14**

    2 腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化

    HE染色顯示,兩對照組動(dòng)物腫瘤生長旺盛,細(xì)胞核較大深染,而治療組與兩對照組相比,瘤組織內(nèi)死亡細(xì)胞較多,細(xì)胞崩解為碎片,細(xì)胞核固縮碎裂,正常組織結(jié)構(gòu)消失,呈現(xiàn)無結(jié)構(gòu)嗜伊紅染色區(qū)等形態(tài)學(xué)改變,見圖2。

    3 腫瘤組織survivin表達(dá)

    由圖3可知,survivin表達(dá)的陽性顆粒主要位于腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi),少數(shù)位于細(xì)胞核和間質(zhì)中。Mock組陽性細(xì)胞為(67.2±11.3)%,scrambled siRNA組陽性細(xì)胞為(71.2±8.91)%,而survivin-siRNA組其表達(dá)明顯降低,陽性率為(31.2±8.3)%,與兩對照組比較差異顯著(P<0.01)。

    Figure2.HE staning for DU145 xenografts treated with survivin-siRNA(×200).Blue arrows represent death cells.圖2 前列腺癌移植瘤HE染色結(jié)果

    Figure3.Immunohistochemical analysis of survivin expression inDU145 xenografts treated with survivin-siRNA( × 200) . Blue arrows represent survivin - positivecells.圖3 前列腺癌移植瘤survivin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

    4 腫瘤細(xì)胞凋亡檢測

    治療組腫瘤組織內(nèi)見大量細(xì)胞核染為棕黃色的凋亡細(xì)胞,而兩對照組僅見少許凋亡細(xì)胞,見圖4。如表2所示,治療組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P <0.01)。

    Figure4.Apoptosis of DU145 xenografts treated with survivinsi RNA detedcted by TUNEL assay(×200).Blue arrows represent apoptotic cells.圖4 TUNEL染色檢測前列腺癌移植瘤細(xì)胞凋亡情況

    表2 Survivin-siRNA對DU145細(xì)胞移植瘤凋亡指數(shù)的影響Table2.Apoptotic index(AI)of DU145 xenografts treated with survivin-siRNA(%..n=5)

    表2 Survivin-siRNA對DU145細(xì)胞移植瘤凋亡指數(shù)的影響Table2.Apoptotic index(AI)of DU145 xenografts treated with survivin-siRNA(%..n=5)

    **P <0.01 vs mock or scrambled siRNA.

    Group AI Mock 4.13 ±1.71 Scrambled siRNA 5.64 ±1.32 Survivin -siRNA 27.90 ±5.91**

    討 論

    Survivin作為新的凋亡抑制因子,其獨(dú)特的組織表達(dá)特異性及促進(jìn)增殖、抑制凋亡等生物學(xué)功能受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。圍繞survivin的分子生物學(xué)特點(diǎn)、生物學(xué)功能,特別是在細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了一系列研究,證實(shí)survivin是一個(gè)多功能的分子[6]。其功能主要包括:(1)在染色體過客蛋白復(fù)合物中定位和有絲分裂中起關(guān)鍵作用;(2)survivin通過caspase和非caspase途徑對腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控;(3)survivin在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況與腫瘤的放、化療抵抗關(guān)系密切,某些藥物可通過抑制survivin的表達(dá)發(fā)揮抗癌效應(yīng)。根據(jù)現(xiàn)有的研究,其抗凋亡作用及在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用已經(jīng)逐步得到肯定[7]。此外,腫瘤細(xì)胞中survivin過表達(dá)會(huì)幫助腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn),從而使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡,實(shí)現(xiàn)異常增殖。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn),用雄激素刺激激素依賴性前列腺癌細(xì)胞(LNCaP)能夠增加survivin的表達(dá),相反,抗激素治療會(huì)降低其表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染增加survivin的表達(dá)還會(huì)降低抗雄激素藥物的治療效果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[9],在LNCaP和激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞(PC-3和DU145)過表達(dá)survivin會(huì)增加對紫杉醇(抗腫瘤藥)的抗性等。

    本課題組應(yīng)用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將特異性survivin-siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌DU145細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)該質(zhì)??纱龠M(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞內(nèi)survivin基因及蛋白表達(dá)[10],為體內(nèi)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制裸鼠前列腺癌皮下移植瘤模型,并在腫瘤內(nèi)注射了DNA,但裸DNA轉(zhuǎn)染效率低,抑制靶蛋白表達(dá)作用不理想。其主要原因可能有:(1)DNA必須穿過細(xì)胞膜;(2)DNA到達(dá)細(xì)胞內(nèi)后,需通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核。因而嚴(yán)重阻礙了該技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。如何提高siRNA的抑制效率,尋找更有效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染手段,日益受到重視。電脈沖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法,克服了病毒載體容量小、具有安全隱患等問題。所謂電脈沖法是將組織置于高壓脈沖電場內(nèi),在注射部位給予短時(shí)間的電脈沖,通過電刺激,使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性穿孔,促使腫瘤周圍DNA滲進(jìn)細(xì)胞內(nèi),易于獲得更多的DNA質(zhì)粒到細(xì)胞質(zhì),但目前尚不清楚是否電刺激有利于質(zhì)粒穿過細(xì)胞核屏障到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)[11]。但有研究表明,電脈沖基因轉(zhuǎn)染效率較單純注射質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)染效率提高近50倍,并可持續(xù)表達(dá),最長可持續(xù)6個(gè)月以上[12]。本實(shí)驗(yàn)利用電脈沖方法將治療質(zhì)粒及對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞內(nèi),結(jié)果證實(shí):與兩對照組相比,survivin-siRNA組在初次治療后15 d腫瘤體積與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),隨著治療時(shí)間的延長,平均瘤體積和瘤重量均明顯降低(P<0.01)。這說明電脈沖介導(dǎo)的基因體內(nèi)治療方法可行,并具備安全、簡單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),具有實(shí)際應(yīng)用前景。

    通過HE染色和TUNEL染色發(fā)現(xiàn),治療組腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡,凋亡指數(shù)明顯升高;免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),survivin-siRNA重組質(zhì)粒降低腫瘤組織內(nèi)survivin蛋白表達(dá),說明survivin-siRNA抑制腫瘤生長是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的,但具體的凋亡途徑還需進(jìn)一步探討。

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