生脈六味地黃湯加減方對(duì)大鼠小腸內(nèi)表面黏膜α-糖苷酶的抑制作用

邢 磊 焦穎華 耿麗華 孫 堯 (河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，河北 唐山 063000)

尋找有效治療2型糖尿病的藥物已成為國(guó)際醫(yī)藥學(xué)界的一個(gè)研究熱點(diǎn)。胰島素療效肯定，肝腎損害小，但易出現(xiàn)低血糖。磺脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類及α-葡萄糖苷酶抑制劑療效肯定，但有原發(fā)失效、繼發(fā)失效及心血管、消化道的副作用。為了克服上述藥物的缺點(diǎn)，我們從傳統(tǒng)中藥復(fù)方入手，通過(guò)中藥復(fù)方的多臟腑同治、整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)，達(dá)到有效控制糖尿病的目的。糖尿病中醫(yī)辨證多為氣陰兩虛證型，生脈六味地黃湯加減方益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)脾益腎，控制心煩口干、神疲乏力等癥。該方控制血糖的作用是否類似于α-糖苷酶抑制劑，通過(guò)α-糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。α-糖苷酶存在于小腸絨毛黏膜細(xì)胞刷狀緣上，具有水解α-1，4糖苷鍵，將多糖水解為葡萄糖的作用〔1〕。α-糖苷酶抑制劑是通過(guò)抑制α-糖苷酶的活性，從而延緩腸道葡萄糖的吸收，達(dá)到控制餐后血糖的目的。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性 Wistar大鼠，體重(220±10)g，由北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。

1.2 藥品及試劑 生脈六味地黃湯加減方:炒黃芪20 g、人參10 g、麥冬 6 g、五味子 5 g、生地黃 25 g、山茱萸 12 g、山藥12 g、澤瀉10 g、茯苓10 g、丹皮10 g(均購(gòu)自安國(guó)藥都集團(tuán)茗都飲片廠);阿卡波糖(Acarbose)(杭州中美華東制藥有限公司，批號(hào):080401);麥芽糖(分析純，汕頭市光華化學(xué)廠，批號(hào)101210);血糖試劑盒(上海科華東菱診斷用品有限公司，批號(hào):20101121)。

1.3 儀器 X-22R低溫離心機(jī)(德國(guó)BECKMAN公司)、酶標(biāo)儀(BIO-RAD)、sartorius電子分析天平、EP管、冰板、96孔板、微量移液器及配套槍頭、燒杯、一次性塑料試管。

1.4 方法及步驟

1.4.1 提取小腸 α-糖苷酶〔2〕雄性 Wistar大鼠1只，禁食24 h，脫臼處死，取約20 cm長(zhǎng)的小腸，擠出內(nèi)容物，剪開(kāi)后，于冰板上刮取內(nèi)表面黏膜，加入2倍量4℃的PBS液，用勻漿器勻漿后于4℃，5 000 r/min離心20 min，取上清液即α-葡萄糖苷酶液，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 測(cè)定酶活力和確定最佳反應(yīng)體系

1.4.2.1 測(cè)定酶活力〔3〕確定反應(yīng)體積為1 000 μl，取酶液50 μl，加 400 μl PBS 液，37℃ 恒 溫 箱反 應(yīng) 10 min，加 入0.25 mol/L的麥芽糖溶液50 μl，反應(yīng)30 min后加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液500 μl終止反應(yīng)。氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量。酶活力單位定義:在37℃，pH6.8的條件下，每分鐘水解底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量，規(guī)定為一個(gè)酶活力單位。

1.4.2.2 確定最佳反應(yīng)體系

1.4.2.2.1 酶濃度的確定 取50 μl麥芽糖溶液，加入2，4，8倍稀釋的酶液50 μl，37℃反應(yīng)20 min，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖的生成量計(jì)算α-糖苷酶的活性。

1.4.2.2.2 確定反應(yīng)底物 在1 000 μl反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為0.125，0.25，0.5 mmol/l的麥芽糖，于37℃恒溫箱反應(yīng)10，20，30 min后，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，計(jì)算葡萄糖生成量，以葡萄糖的生成量計(jì)算α-糖苷酶活性。

1.4.2.3 生脈六味地黃湯加減方對(duì)α-糖苷酶的影響

1.4.2.3.1 生脈六味地黃湯加減方的制備〔2〕稱取60 g生脈六味地黃湯加減方飲片，加600 ml純凈水，浸泡30 min，煎煮20 min，取上清液濃縮為60 ml，即得1 g/ml的溶液。將所得溶液用純凈水稀釋成 0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000 mg/ml不同濃度的溶液。不同濃度的溶液各取10 ml，加入活性炭0.02 g〔4〕，脫色 15 min，離心取上清，即得脫色液。阿卡波糖100 mg(2片)溶于10 ml純凈水中，混勻后稀釋成0.001、0.01、0.1、1、10 mg/ml不同濃度的溶液。上述溶液均于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.3.2 生脈六味地黃湯加減方對(duì)α-糖苷酶的影響 ①上述每種溶液各取100 μl，加PBS液300 μl，再加入4倍稀釋的酶液50 μl;②對(duì)照管加 PBS 液 400 μl，再加 4 倍稀釋的酶液50 μl;③空白組只加 PBS 液 50 μl，37℃ 恒溫箱反應(yīng) 10 min;④除空白組不加麥芽糖溶液外，其余各管均加入0.25 mol/L麥芽糖溶液50 μl，37℃恒溫箱反應(yīng) 20 min后;⑤加入0.1 mol/L Na2CO3溶液500 μl終止反應(yīng)，空白組不加Na2CO3溶液;⑥各反應(yīng)液各取20 μl放入96孔板孔中，再加1∶1稀釋的酚酶試劑20 μl，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，37℃恒溫箱反應(yīng) 10 min;⑦酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值A(chǔ)。

2 結(jié)果

2.1 確定的最佳反應(yīng)體系 取待測(cè)溶液1 000 μl，加PBS液300 μl，再加入 4 倍稀釋的酶液 50 μl，37℃恒溫箱反應(yīng) 10 min，加入0.25 mol/l的麥芽糖溶液50 μl，37℃反應(yīng)20 min后，加入Na2CO3液500 μl終止反應(yīng)，此為最適合反應(yīng)體系。

2.2 生脈六味地黃湯加減方對(duì)α-糖苷酶的影響 生脈六味地黃湯加減方對(duì)α-糖苷酶影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:生脈六味地黃湯加減方對(duì)α-糖苷酶有明顯的抑制作用，且最高抑制率大于50%。但因該中藥高溶液顏色較深，影響吸光度值，進(jìn)而使計(jì)算出的抑制率下降，故用活性炭脫色。脫色后高濃度藥物，如100 mg/ml溶液抑制率升高，但同時(shí)低濃度溶液的抑制率明顯較脫色前降低，說(shuō)明活性炭脫色時(shí)，也將部分藥物有效成分脫掉了，結(jié)果見(jiàn)表1。

阿卡波糖組在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的濃度效應(yīng)關(guān)系:隨藥物濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。生脈六味地黃湯加減方在10 mg/ml濃度范圍以下具有良好的濃度效應(yīng)關(guān)系，在該濃度之上因顏色及其他因素影響抑制率迅速下降。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 生脈六味地黃湯加減方及脫色后復(fù)方對(duì)α－糖苷酶抑制率及與阿卡波糖的比較(%，n=3)

3 討論

糖尿病屬中醫(yī)的消渴病病癥范疇。在消渴病的常見(jiàn)發(fā)病類型中，以氣陰兩虛最為多見(jiàn)。其癥狀可見(jiàn)神疲乏力，面色不華，心煩口干，精神不集中，失眠，舌紅少苔，脈細(xì)弱。針對(duì)該類型我們從益氣養(yǎng)陰入手，以生脈六味地黃湯加減方治療該癥型。生脈散出自《內(nèi)外傷辯惑論》:益氣養(yǎng)陰，復(fù)脈固脫，該方主治氣陰兩傷所致的體倦氣短、脈細(xì)弱。六味地黃丸能滋陰補(bǔ)腎，用于治療頭暈耳鳴，失眠，心煩口干，腰膝酸軟等腎陰虧耗癥。另加大劑量炒黃芪益氣健脾，糾正倦怠乏力、食欲不振等癥狀。生脈散和六味地黃丸兩方合用可達(dá)到益氣養(yǎng)陰，滋補(bǔ)腎陰的作用;再加上大劑量黃芪，益氣健脾;全方共奏脾腎同治，益氣養(yǎng)陰之功?，F(xiàn)代藥理研究表明:該方中的山茱萸、五味子〔1〕、黃芪、人參、山藥〔5〕、生地黃〔2〕有類似 α-糖苷酶抑制劑的作用，麥冬和澤瀉也具有明顯地降血糖作用。

α-糖苷酶抑制劑延緩復(fù)雜碳水化合物和雙糖的分解和消化，降低餐后血糖的作用機(jī)制明確，療效確切。該類藥物包括阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，而阿卡波糖臨床應(yīng)用較廣泛，故本次實(shí)驗(yàn)選用阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照組。

α-糖苷酶實(shí)驗(yàn)所用酶主要有大鼠小腸提取酶和人工合成酶兩種，有研究表明用兩種酶做出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同，而大鼠小腸酶的成本較低，故本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用新鮮提取的Wistar大鼠小腸酶做實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)藥物的糖苷酶抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)藥物作用后的吸光度值計(jì)算抑制率，吸光度值測(cè)定時(shí)受顏色影響較大，顏色越深，吸光度值越大。生脈六味地黃湯加減方溶液顏色較深，影響吸光度，為減少藥物顏色的影響因素，我們采用活性炭脫色法祛除部分顏色，觀測(cè)抑制率的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度溶液顏色較深，抑制率明顯下降，而應(yīng)用活性炭脫色后，顏色變淺，抑制率有所上升;在較低濃度溶液中脫色后α-糖苷酶抑制率相應(yīng)降低。本實(shí)驗(yàn)表明活性炭能明顯改善高濃度溶液因嚴(yán)重顏色影響計(jì)算出的抑制率，但同時(shí)也將部分有效成分脫掉了，在一定比例上降低了原有藥物的實(shí)際抑制率。是否能找到既能排除顏色影響，又能更好地測(cè)定出藥物的實(shí)際抑制作用的方法，將成為我們下一步的實(shí)驗(yàn)研究目標(biāo)。

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