突變型α突觸核蛋白對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)存活率的影響

王 鵬 許 潔 安恩訓(xùn) 于 順 何 欣

(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生變性壞死，以及路易小體(Lewy body)和路易軸索(Lewy neurite)的形成〔1，2〕是帕金森病(PD)的主要病理特征。α－突觸核蛋白(Syn)的變性聚集是參與形成淀粉樣變性的主要成分，主要分布于突觸前膜和核膜〔3，4〕。Syn與微管蛋白之間存在分子伴侶關(guān)系。體外實(shí)驗(yàn)證明，α－Syn能夠促進(jìn)微管蛋白的聚合，加速微管的形成〔5〕。在PD患者腦中，α－Syn被證明與 α－tubulin、tau蛋白以及 MAP1B共存于 Lewy body中〔6，7〕，但其生理功能仍未完全清楚。一些家族性 PD患者的 α－Syn基因中第88位堿基發(fā)生G－C突變，導(dǎo)致氨基酸序列第30位丙氨酸(Ala)變成脯氨酸(Pro)(A30P);另有第209位核苷酸發(fā)生了G－A突變，使氨基酸序列中第53位丙氨酸(Ala)變成蘇氨酸(Thr)(A53T)。突變的α－Syn A53T和A30P出現(xiàn)生理功能異常，在PD發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用。本研究旨在觀察A53T和A30P對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)元存活率的影響，進(jìn)一步明確突變體α－Syn的生理功能，為揭示二者導(dǎo)致家族性PD發(fā)病的機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM(F－12)細(xì)胞培養(yǎng)基，購(gòu)自 GIBCO公司;BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒BCA Protein Assay Kit，購(gòu)自寶生物;α－Syn單克隆抗體3D5，由宣武醫(yī)院老年病研究所神經(jīng)生物研究室制備;FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體，購(gòu)自中衫公司;蛋白分子量Marker，購(gòu)自Pharmacia;胎牛血清(FBS)和馬血清(HS)，購(gòu)自HyClone。其他均為化學(xué)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生24 h的Wistar大鼠40只，雌雄不限，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK－(軍)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組蛋白的克隆與純化 將α－Syn和家族性突變體A53T、A30P的cDNA分別插入pET(3a)，然后轉(zhuǎn)至BL21(DE3)中，在含氨芐西林的YTA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。所表達(dá)的基因重組型蛋白采用離子交換層析和反向?qū)游龇兓?。純化后的蛋白用SDS－PAGE法鑒定，BCA法定量。

1.3.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 將新生24 h的大鼠斷頭取腦，置于D－Hank緩沖液中，剝凈血管腦膜。剝離皮質(zhì)與髓質(zhì)，剪成若干小塊。胰酶消化45 min后吹散，200目篩網(wǎng)過(guò)濾。800 r/min離心2 min。棄上清，細(xì)胞沉淀用DMEM培養(yǎng)基混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)。以每皿0.75×105個(gè)的密度接種在用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。加入相應(yīng)蛋白分組，進(jìn)行觀察。

1.3.3 神經(jīng)元培養(yǎng)觀察 培養(yǎng)至第1、2、4小時(shí)，向培養(yǎng)皿中添加終濃度為1%的戊二醛，固定1 h。隨機(jī)挑選30個(gè)視野，每視野有5個(gè)以上神經(jīng)元。10×40光鏡下觀察，照片分辨率1 300×1 030，TIF格式。

1.3.4 Western印跡法和免疫熒光法鑒定α－Syn的作用 培養(yǎng)至觀察時(shí)間，吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，PBS沖洗，刮下細(xì)胞。功率200 W，2次30 s超聲破碎。破碎后的溶液加入SDS－PAGE上樣緩沖液，沸水中煮5 min。4℃，12 000 r/min，離心20 min。棄沉淀，取30 μl上清作為樣品，進(jìn)行SDS－PAGE電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，封閉。沖洗后，以1∶1 000比例稀釋的3D5抗體反應(yīng)過(guò)夜。洗膜，加入1∶5 000稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液反應(yīng)。沖洗后，ECL法顯示條帶并鑒定結(jié)果。

培養(yǎng)細(xì)胞固定，沖洗培養(yǎng)皿。以含10%羊血清的PBST封閉1 h。棄封閉液，加入1∶5 000稀釋的3D5抗體1.5 ml，4℃過(guò)夜。PBST沖洗，加入1∶500稀釋的 FITC標(biāo)記羊抗鼠抗體，37℃，2 h;吸棄反應(yīng)液，PBST沖洗。熒光顯微鏡下觀察并鑒定結(jié)果。

1.3.5 培養(yǎng)分組方案 向原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中添加終濃度為20 μmol/L 的 α－Syn、突變型 A53T、A30P 和 BSA，培養(yǎng)至第1、2、4小時(shí)觀察。分別添加終濃度為20、40、60 μmol/L的相應(yīng)蛋白，培養(yǎng)至4 h，觀察突起長(zhǎng)度變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以±s表示，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)。兩變量的相關(guān)分析采用Bivariate過(guò)程的Pearson直線相關(guān)法。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白純化鑒定結(jié)果 SDS－PAGE鑒定，經(jīng)純化得到純度較高的 α－Syn 和 A53T、A30P，見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白純化后SDS-PAGE電泳圖

圖2 α-Syn和其突變體A53T、A30P對(duì)神經(jīng)元存活率的影響

2.2 α－Syn、A53T和A30P對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)元存活率的影響見(jiàn)圖2。培養(yǎng)至1、2 h，添加α－Syn組的神經(jīng)元數(shù)目大于對(duì)照組(P＜0.05)，A53T組和A30P組與對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05)。培養(yǎng)至4 h，α－Syn組存活神經(jīng)元數(shù)目明顯大于對(duì)照組(P＜0.01)，A53T組和A30P組與對(duì)照組之間無(wú)差異(P＞0.05)。添加不同濃度的蛋白，α－Syn組神經(jīng)元存活率隨濃度增加而增加，而A53T組和A30P組無(wú)變化。α－Syn從培養(yǎng)基進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，A53T和A30P不能進(jìn)入神經(jīng)元。Western印跡結(jié)果顯示α－Syn組神經(jīng)細(xì)胞裂解液呈清晰條帶，為陽(yáng)性;A30P、A53T和對(duì)照組均為陰性(圖3A)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示α－Syn神經(jīng)元顯色為陽(yáng)性，對(duì)照組、A53T和A30P組不顯色，為陰性(見(jiàn)圖3B)。

圖3 外源α-Syn、A53T和A30P在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)

3 討論

Sung等發(fā)現(xiàn)α－Syn抑制H19－7大鼠海馬神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在原代神經(jīng)元培養(yǎng)初期(4 h內(nèi))，α－Syn提高原代培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率，而A53T和A30P對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)無(wú)影響。原代培養(yǎng)的神經(jīng)元在培養(yǎng)皿以貼壁方式生長(zhǎng)。生長(zhǎng)初期，微管在神經(jīng)細(xì)胞的軸突和樹(shù)突中起支撐作用，幫助突起生長(zhǎng)。突起復(fù)發(fā)出對(duì)神經(jīng)元貼壁起關(guān)鍵作用。有研究證明，α－Syn有與tau蛋白相似，可以促進(jìn)微管蛋白合成微管〔9〕。通過(guò)促進(jìn)微管的合成，α－Syn可幫助神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，提示α－Syn很可能參與神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育階段神經(jīng)元突起的形成以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)。α－Syn提高原代培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率與這一作用也密切相關(guān)。而A53T和A30P對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)無(wú)影響，可能與其發(fā)生家族性突變有關(guān)。正常α－Syn蛋白分子含有穿梭序列，該序列能夠介導(dǎo) α－Syn穿過(guò)細(xì)胞膜〔10，11〕。而30和53位氨基酸的突變導(dǎo)致α－Syn的構(gòu)象改變不能進(jìn)入神經(jīng)元，失去提高神經(jīng)元存活率的能力。家族PD患者由于發(fā)生α－Syn的突變，可能影響微管的合成和有序排列，致使神經(jīng)元軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂或修復(fù)和重建障礙，導(dǎo)致細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)無(wú)定形物形成聚集，發(fā)生多巴胺能神經(jīng)元死亡。此研究結(jié)果為揭示α－Syn突變型A53T和A30P的生理功能及其與微管蛋白的關(guān)系提供了新證據(jù)，對(duì)揭示α－Syn突變導(dǎo)致神經(jīng)元退行性死亡的機(jī)制具有重要意義。

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