葛根素聯(lián)合雌二醇對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用

李 海 王金花 黃海玲 陳建海 黎 飚 (右江民族醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

Ⅰ型骨質(zhì)疏松(OP)即絕經(jīng)后OP是中老年婦女的常見病和多發(fā)病，其防治已成為備受關(guān)注的課題〔1～3〕。西醫(yī)用雌孕激素替代治療效果明顯，但副作用大，并發(fā)癥多，中醫(yī)治療有些病例療效不理想，任何一種藥物和方法的單一使用都不盡人意。如果中西結(jié)合治療，減少激素用量，就減少治療的副作用和并發(fā)癥〔4～7〕。目前單獨(dú)用西藥或中草藥對絕經(jīng)后OP實(shí)驗(yàn)室動物模型的研究較多，中藥和西藥同時用藥的動物實(shí)驗(yàn)研究較少。小劑量葛根素與雌二醇(E2)對去卵巢大鼠動物模型骨組織、骨密度(BMD)影響的實(shí)驗(yàn)研究，為中西醫(yī)結(jié)合治療絕經(jīng)后OP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組 選用120只5月齡健康雌性SPF級SD大白鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK桂2009-002)，葛根素注射液(成都天臺制藥廠 100 mg/支，批號:0905053)，苯甲酸雌二醇 (100 μg/支，浙江仙居制藥廠，批號:0908072)。按體重編號，手術(shù)前將120只SD大白鼠隨機(jī)分成5組(n=24)，給予分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。各組大白鼠照明、通風(fēng)、溫度、濕度等飼養(yǎng)環(huán)境條件相同。

1.2 去卵巢動物模型的建立 隨機(jī)取4組大白鼠用10 g/L戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉(3.0 mg/kg)，無菌條件下經(jīng)腰背部雙側(cè)切口進(jìn)入腹腔，切除雙側(cè)卵巢，切口分層縫合。切下的卵巢經(jīng)組織學(xué)鑒定確認(rèn)。術(shù)后用慶大霉素注射3 d，防止傷口感染。1 w后用藥組開始用藥。

1.3 假手術(shù)(sham)組的建立 手術(shù)方法與去卵巢動物模型組的手術(shù)方法相同，只切除卵巢旁的一小塊脂肪墊，不切除卵巢。術(shù)后用慶大霉素注射3 d，防止傷口感染。

1.4 手術(shù)后分組 ①sham組;②去卵巢模型組(OVX);③葛根素(Pr)組;④雌二醇(E2)組;⑤葛根素(Pr+E2)組。

1.5 三個治療組的用藥 Pr組定期定量皮下注射葛根素50 mg/kg，1 次/d。E2組定期定量皮下注射 E2200 μg/kg，2次/w。Pr+E2組定期定量皮下注射小劑量 E2100 μg/kg，2次/w和小劑量葛根素25 mg/kg，1次/d。

1.6 觀察的指標(biāo) ①血清E2;②血清堿性磷酸酶(AKP);③股骨BMD;④光鏡下的骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.7 觀察的時間和方法 各實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)后第4、8、12周和第20周隨機(jī)取6只大鼠用10 g/L戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉(3.0 mg/kg)后再處死。①取左側(cè)股骨經(jīng)固定、脫鈣、脫水、石蠟包埋，再切片HE染色200倍光鏡觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu);②取右側(cè)股骨分離軟組織后烘干用XR-600雙能X光骨密度測量儀測量BMD，掃描寬度為1.5 cm，長度為4.3 cm，掃描速度為4.0 s/m。③采左心血5 ml，4 000 r/min、10 min 分離血清，保存于－20℃冰箱待測。用放免方法測定血清E2，血清AKP用比色法測定，用南京建成生物工程公司生產(chǎn)的磷試劑盒，722型可見分光光度計(jì)測定血堿性磷酸酶的含量，按說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組的血清E2測量結(jié)果 見表1。OVX組第4、8、12周和第20周血E2與sham組、Pr組、E2組和 Pr+E2組相比有顯著差異(P＜0.01)，Pr+E2組血E2與同時期Pr組、E2組相比無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組的血AKP測量結(jié)果 見表2。OVX組的第4、8、12周和第20周血AKP與sham組、Pr組、E2組和 Pr+E2組相比有顯著差異(P＜0.01)，Pr+E2組血AKP與同時期Pr組、E2組相比無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 各實(shí)驗(yàn)組BMD測量結(jié)果 見表3。OVX組的第4、8、12、20周BMD明顯低于同時期sham組、Pr組、E2組和 Pr+E2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組的血清E2測量結(jié)果(x ±s，ng/L，n=6)

2.4 光鏡下的骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu) sham組骨組織的骨密質(zhì)較厚，骨細(xì)胞整齊排列，骨小梁結(jié)構(gòu)緊密，大小均勻，骨小梁的橫向聯(lián)接較多。OVXXEG骨密質(zhì)比較薄，骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨小梁稀疏、纖細(xì)、大片斷裂、排列紊亂，髓腔增大，鈣鹽沉積減少。Pr、E2和Pr+E2與去OVX組比較，OP的病理改變改善明顯，骨密質(zhì)增厚，骨小梁變粗，變密。三個治療組骨組織切片光鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯的區(qū)別見圖1。

表2 各實(shí)驗(yàn)組的血AKP測量結(jié)果(x ±s，IU/L，n=6)

表3 各實(shí)驗(yàn)組BMD測量結(jié)果(±s，g/cm2，n=6)

表3 各實(shí)驗(yàn)組BMD測量結(jié)果(±s，g/cm2，n=6)

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圖1 各組骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE，×200)

3 討論

骨組織的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都有雌激素受體〔8，9〕，骨組織形成和溶解都受到雌激素的調(diào)節(jié)。雌激素與成骨細(xì)胞的受體相結(jié)合，促進(jìn)成骨細(xì)胞膠原蛋白合成、類骨質(zhì)的形成和鈣鹽的沉積，從而形成骨組織〔10～12〕;雌激素與破骨細(xì)胞的受體相結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的溶骨功能。當(dāng)雌激素減少或雌激素受體與雌激素結(jié)合能力下降時，引起成骨細(xì)胞成骨功能下降，破骨細(xì)胞破骨功能增強(qiáng)，導(dǎo)致溶骨功能增強(qiáng)，破骨大于成骨，骨質(zhì)流失，出現(xiàn)OP，導(dǎo)致OVX組股骨出現(xiàn)明顯OP病理改變和股骨BMD明顯降低。血清AKP是骨代謝最好的觀察指標(biāo)，去卵巢大鼠雌激素下降，骨代謝呈高轉(zhuǎn)換率，所以O(shè)VX組血清堿性磷酸酶明顯升高，而各個治療組血清AKP接近正常對照組。

本文結(jié)果證明Pr和E2對去卵巢大白鼠的OP都有較好療效。Pr對去卵巢大白鼠OP的療效已得到大量實(shí)驗(yàn)所肯定〔13，14〕，葛根素主要成分是葛根異黃酮，它有雌激素樣的藥理作用，而沒有雌激素副作用。葛根素在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為雌激素。骨組織切片能直觀反映骨形態(tài)結(jié)構(gòu)，是OP最客觀診斷指標(biāo)，BMD檢查是OP臨床實(shí)際診斷的金指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小劑量的Pr聯(lián)合E2也能使骨密質(zhì)增厚，血清E2、AKP和BMD接近正常，此治療方案可減少雌激素用量，從而減少雌激素引起不良反應(yīng)，為中西醫(yī)治療治療絕經(jīng)后OP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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