α7尼古丁受體mRNA表達(dá)抑制對(duì)SH－SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

歐陽凱 齊曉嵐 官志忠 (貴陽醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

在阿爾茨海默病(AD)患者大腦皮層腦組織中神經(jīng)型尼古丁受體的表達(dá)水平降低，膽堿能神經(jīng)的功能缺陷在AD發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用。氧化應(yīng)激是指自由基產(chǎn)生過多或抗氧化物質(zhì)水平減少而使兩者之間的平衡失調(diào)所造成的損傷，在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生過程中起著重要作用。大量研究表明，AD是由多種因素共同作用引起的，自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是AD的主要發(fā)病機(jī)制之一〔1〕。RNA干擾 (RNAi)是通過具有一定結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的，長約19～25 bp的小干擾 RNA(siRNA)，導(dǎo)人哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，能高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的過程〔2〕。本研究用體外合成的 siRNA抑制SH－SY5Y細(xì)胞 α7 nAChR的表達(dá)，研究其受抑制后對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響，從而探討α7 nAChR對(duì)AD的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 源于人腦的 SH－SY5Y細(xì)胞由本課題組保存;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購于HyClone公司;鼠抗α7多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠抗兔二抗、α7 nAChR siRNA、siRNA熒光質(zhì)控、siRNA 轉(zhuǎn)染試劑、siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基均購于Santa Cruz公司;Oligo dT、dNTP購于上海生工公司;Trizol試劑購于Invitrogen公司;M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于Promega公司;RNA酶抑制劑購于Toyobo公司;TaqMan Universal 2 ×PCR Mix、α7 nAChR 和內(nèi)對(duì)照 β－actin Taq－man 探針均購于 Applied Biosystems公司;鼠抗 β－肌動(dòng)蛋白(β－actin)、Aβ1～42購于Sigma公司;聚乙烯二氟 (PVDF)膜、ECL－Plus發(fā)光試劑、高效顯影膠片購于Amersham公司;顯影液、定影液購于柯達(dá)公司;脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－PX)測定試劑盒購于南京建成公司;細(xì)胞裂解液購于碧云天公司;普通化學(xué)試劑均購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH－SY5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM，加入15%胎牛血清、1%雙抗(青霉素 100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)。培養(yǎng)箱中含5%CO2，溫度為37℃。

1.2.2 siRNA的轉(zhuǎn)染 生長良好的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化傳入六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其匯合度達(dá)80%時(shí)按siRNA轉(zhuǎn)染說明書按不同比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染siRNA熒光質(zhì)控，根據(jù)熒光值摸索和優(yōu)化siRNA的轉(zhuǎn)染條件。分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 siRNA、α7 nAChR siRNA，轉(zhuǎn)染后6 h換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基和細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照，每一轉(zhuǎn)染設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.3 α7 nAChR沉默效率檢測 采用 Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行 Real－time PCR。所用試劑為 TaqMan Universal 2×PCR Mix，α7 nAChR(Hs01063372_m1) 和 內(nèi) 對(duì) 照 β－actin(Hs01060665_g1)Taqman探針購自Applied Biosystems公司，ABI Step One plus型熒光定量PCR儀采集待測基因及內(nèi)參照β－actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)，以Applied Biosystems SDS1.4軟件進(jìn)行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。SDS1.4軟件分析其△△Ct值及RQ 值，RQ=2－△△Ct。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)以 β－actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算α7 nAChR mRNA和對(duì)照組的相對(duì)水平。

收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白并定量，用 Western印跡方法檢測α7 nAChR的蛋白表達(dá)水平。以 β－actin作為內(nèi)對(duì)照。以Labworks軟件分析結(jié)果時(shí)以β－actin蛋白條帶作為內(nèi)參照，計(jì)算α7 nAChR蛋白條帶與 β－actin蛋白條帶像素灰度的百分比值。

1.2.4 細(xì)胞分組及Aβ1～42處理 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后換無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基1 ml 12 h，加入Aβ1～42使其終濃度為1 μmol/L，按以下分組:空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA 組、空白對(duì)照 +Aβ1～42組、陰性對(duì)照 +Aβ1～42組、轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA+Aβ1～42組。

1.2.5 脂質(zhì)過氧化水平測定 收集培養(yǎng)基，按測試盒說明書操作。采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定丙二醛(MDA)含量，氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此產(chǎn)生MDA，MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。

1.2.6 SOD和GSH－PX活性測定 收集細(xì)胞，超聲裂解提取蛋白并定量，按測試盒說明書操作。SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，GSH－PX活性采用比色定量法。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后 α7 nAChR mRNA水平和蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染針對(duì)α7 nAChR基因的siRNA后SH－SY5Y細(xì)胞α7 nAChR mRNA水平和蛋白表達(dá)水平分別下降了81.7%和76.9%(表1)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照與對(duì)照組相比無差異。說明已將 α7 nAChR siRNA轉(zhuǎn)入人 SH－SY5Y細(xì)胞，且抑制了 α7 nAChR mRNA和蛋白水平的表達(dá)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染α7 nAChR基因沉默細(xì)胞構(gòu)建成功。

2.2 脂質(zhì)過氧化水平 轉(zhuǎn)染針對(duì)α7 nAChR基因的siRNA及用1 μmol/L Aβ1～42處理 SH－SY5Y 細(xì)胞均能使細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平升高，且α7 nAChR基因沉默后能增強(qiáng)Aβ神經(jīng)毒性作用。見表2。

2.3 SOD活性和GSH－PX活性 轉(zhuǎn)染針對(duì)α7 nAChR基因的siRNA 及用 1 μmol/L Aβ1－42處理 SH－SY5Y 細(xì)胞均能使細(xì)胞SOD活性和GSH－PX活性降低，且α7 nAChR基因沉默后能增強(qiáng)Aβ的神經(jīng)毒性作用。見表2。

表1 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)水平(±s，n=3)

表1 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)水平(±s，n=3)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01

?

表2 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后細(xì)胞MDA水平及SOD，GSH-PX活性(±s，n=3)

表2 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后細(xì)胞MDA水平及SOD，GSH-PX活性(±s，n=3)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01，與對(duì)照+Aβ組比較:2)P＜0.01

?

3 討論

RNA干擾(RNAi)能特異性抑制基因表達(dá)，是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(PTGS)。RNAi通過小的dsRNA高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，促使其mRNA特異性降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的過程，具有高特異性、高穩(wěn)定性、高效率性、高穿透性等特性〔2〕。目前RNAi技術(shù)已廣泛用于功能基因組學(xué)、基因治療學(xué)、新的藥物開發(fā)等眾多領(lǐng)域。

尼古丁乙酰膽堿受體是一類明確的具有神經(jīng)保護(hù)功能的受體，其減少與AD的發(fā)生有關(guān)。AD患者腦中膽堿能系統(tǒng)嚴(yán)重受損，腦組織中多個(gè)區(qū)域中尼古丁受體水平降低，AD患者大腦尼古丁受體密度降低。在活體組織和尸檢組織中也發(fā)現(xiàn)尼古丁受體水平的下降。在 APPSWE大鼠標(biāo)本中可見 α7 nAChR的選擇性升高，提示α7 nAChR的升高是對(duì)Aβ毒性作用的一種保護(hù)機(jī)制。但α7 nAChR保護(hù)作用的機(jī)制并不清楚，因此本研究用體外合成的 siRNA抑制 SH－SY5Y細(xì)胞 α7 nAChR的表達(dá)，并研究其表達(dá)受抑制后細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、SOD和GSH－PX活性的變化，以進(jìn)一步研究 α7 nAChR神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

AD的主要病理變化有SPs、NFT及神經(jīng)元死亡等。氧化應(yīng)激與AD的這三個(gè)主要病理變化都相關(guān)〔3〕。氧化應(yīng)激在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生過程中起著重要作用。在自由基產(chǎn)生過多或抗氧化平衡被破壞時(shí)可通過攻擊細(xì)胞膜性脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA而造成細(xì)胞損傷。大腦細(xì)胞由于其細(xì)胞膜含有大量的對(duì)自由基的攻擊較敏感的多不飽和脂肪酸，因而容易受到自由基的損傷，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。已發(fā)現(xiàn)AD病人腦組織中神經(jīng)元胞漿、胞核及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中蛋白氧化產(chǎn)物－蛋白羰基水平升高〔4〕。另外，在AD病人的尸檢報(bào)告中指出:在NFT形成部位存在蛋白羰基和脂質(zhì)過氧化物水平升高〔5〕。在Aβ過度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了與AD病人類同的氧化損傷表現(xiàn)，并且損傷程度與Aβ的沉積呈明顯正相關(guān)〔6〕。在對(duì)臨床AD病人的診斷研究中也發(fā)現(xiàn)，AD病人腦脊液中氧化應(yīng)激標(biāo)志物，如8－羥基－2－脫氧鳥苷酸等含量均升高〔7〕。有研究表明，氧化應(yīng)激是AD發(fā)生的早期表現(xiàn)，是發(fā)生于SPs和NFT的上游病理事件〔8〕，與其他AD發(fā)生的可能機(jī)制相比，氧化應(yīng)激在AD的發(fā)病機(jī)制中可能更為重要。

SOD可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對(duì)細(xì)胞的傷害。GSH－PX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，它特異地催化GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物的干擾及損害。測定這些指標(biāo)可反映機(jī)體內(nèi)源性抗氧化能力。本研究表明siRNA有效地抑制了α7 nAChR的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 (MDA)水平升高、SOD和GSH－PX活性降低明顯，氧化應(yīng)激增強(qiáng)。用Aβ1～42處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激水平升高，說明Aβ可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起細(xì)胞損傷;且轉(zhuǎn)染針對(duì)α7 nAChR基因的siRNA后能夠增強(qiáng)Aβ的神經(jīng)毒性作用。說明α7 nAChR能對(duì)抗細(xì)胞氧化應(yīng)激從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 Qi XL，Xiu J，Shan KR，et al.Oxidative stress induced by beta－amyloid peptide is involved in the altered composition of cellular membrane lipids and the decreased expression of nicotinic receptors in human SH－SY5Y neuroblastoma cells〔J〕.Neurochem Int，2005;46(8):613－21.

2 Aigner A.Gene silencing through RNA interference(RNAi)in vivo:Strategies based on the direct application of siRNAs〔J〕.J Biotechno，2006;124(1):12－25.

3 Resende R，Moreira PI，Proenca T，et al.Brain oxidative stress in a triple transgemic mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.Free Radic Biol Med，2008;44(12):2051－7.

4 Moreira PI，Santos MS，Oliveira CR，et al.Alzheimer disease and the role of free radicals in the pathogenesis of the disease〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targets，2008;7(1):3－10.

5 Polidori MC.Oxidative stress and risk factors for Alzheimer′s disease:clues to prevention and therapy〔J〕.J Alzheimer Dis，2004;6(2):185－91.

6 Mao P，Reddy PH.Aging and amyloid beta－induced oxidative DNA damage and mitochondrial dysfunction in Alzheimer′s disease:implications for early intervention and therapeutics〔J〕.Biochim Biophys Acta，2011;1812(11):1359－70.

7 Ghidoni R，Benussi L，Paterlini A，et al.Cerebrospinal fluid biomarkers for Alzheimer′s disease:the present and the future〔J〕.Neurodegener Dis，2011;8(6):413－20.

8 Maruszak A，Zekanowski C.Mitochondrial dysfunction and Alzheimer′s disease〔J〕.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2011;35(2):320－30.