p53基因多態(tài)性與鼻咽癌遺傳易感性的關(guān)系

樓建軍 朱小東 曲 頌 潘聞燕 李小宇 (廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

鼻咽癌(NPC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在頭頸部惡性腫瘤中占首位。據(jù)統(tǒng)計(jì):世界上大多數(shù)地區(qū)NPC的發(fā)病率在1/10萬(wàn)以下，而我國(guó)南方某些地區(qū)高達(dá)33/10萬(wàn)(男)、15.60/10萬(wàn)(女)〔1，2〕。p53基因與 NPC 發(fā)生的關(guān)系引起了研究者的注意。本研究收集了臨床資料完整的NPC病人的血液標(biāo)本和對(duì)照人群的血液標(biāo)本，研究p53基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與NPC發(fā)生的關(guān)系，為NPC基礎(chǔ)研究和臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2010年3月至2011年9月在我院放療科住院的NPC患者(NPC組)200例。男女各100例，年齡25～70〔平均(47±19)〕歲。所有患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，住院前均未接受過(guò)化學(xué)治療、放射治療或生物治療等干預(yù)措施。主要臨床表現(xiàn):頸部包塊84例;鼻部癥狀:血涕70例，鼻堵42例，鼻出血19例;耳部癥狀56例;頭痛43例;顱神經(jīng)癥狀48例。對(duì)照組200例，為同期身體健康的志愿獻(xiàn)血者，男女各100例，年齡21～50〔平均(38±12)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 由Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游5′－GAGGAGGGACGGTTGGTT－3′;下游 5′－GGTGAGTGAGGAGGTGCTG－3′。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 25 μl反應(yīng)體系含2 ×PCR TaqMix 12.5 μl，滅菌水 9.5 μl，DNA 模板 1.0 μl，上游引物 1.0 μl，下游引物1.0 μl。PCR反應(yīng)采用型號(hào) PXE0.2、Thermo公司的 PCR儀。95℃預(yù)變性，5 min;進(jìn)入循環(huán):變性95℃，30 s;退火61℃，30 s;延伸72℃，30 s;共30個(gè)循環(huán)。終末延伸72℃，8 min。取PCR產(chǎn)物8 μl在含溴乙啶的2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)(Alphalmager，美國(guó))觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化(試劑盒法) 試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司。

1.2.5 酶切反應(yīng)體系 體系為10 μl，其中 PCR純化產(chǎn)物5.0 μl，10 × 限制性內(nèi)切酶緩沖液 1.0 μl，AciI 內(nèi)切酶 0.3 μl，滅菌雙蒸水 3.7 μl，37℃溫育 16 h。

1.2.6 測(cè)序分析 隨機(jī)挑選部分PCR純化產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序，以檢驗(yàn)分型是否準(zhǔn)確。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間人群基因進(jìn)行Hardy－Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)為180 bp，見(jiàn)圖1。

2.2 酶切結(jié)果分析 p53基因rs117562731位點(diǎn)野生純合子基因型為CC型，電泳圖上見(jiàn)115 bp和65 bp的兩條帶;突變純合子基因型TT型，電泳圖上見(jiàn)180 bp一條帶;雜合子基因型為CT型，電泳圖上見(jiàn)180 bp、115 bp和65 bp的三條帶。見(jiàn)圖2。

2.3 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢測(cè) 將兩組的等位基因頻率進(jìn)行Hardy－Weinberg遺傳平衡吻合度檢測(cè)，各基因型頻率與期望值吻合度較好，基因型分布符合Hardy－Weinberg遺傳平衡(P＞0.05)。

2.4 p53基因與NPC的相關(guān)性分析 在NPC組攜帶CC、CT及TT基因型頻率分別為80.0%、17.0%和3.0%，在對(duì)照組中分別為93.0%、5.5%和1.5%。CT+TT基因型發(fā)生NPC的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的3.321倍(P=0.000，OR=3.321，95%CI:1.744～6.326)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.5 NPC組臨床特征與p53基因 rs117562731位點(diǎn)多態(tài)性比較 根據(jù)臨床特征進(jìn)一步分析，結(jié)果提示各基因型與T分期、N分期及M分期無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 rs117562731位點(diǎn)PCR擴(kuò)增目的片段為180 bp

表2 NPC組不同臨床分型與p53 rs117562731多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析〔n(%)〕

圖2 rs117562731位點(diǎn)酶切圖

表1 p53 rs117562731基因型與NPC風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系〔n(%)，n=200〕

3 討論

p53基因編碼一種分子量為53 000的磷酸化蛋白質(zhì)，所以稱為p53基因。正常p53基因的生物學(xué)功能好似“基因組衛(wèi)士”，在G1期檢測(cè)DNA的損傷點(diǎn)，監(jiān)視細(xì)胞基因組的完整性。如果DNA有損傷，p53基因阻止DNA復(fù)制，使損傷的DNA得以修復(fù);若修復(fù)成功，DNA繼續(xù)復(fù)制;如果修復(fù)失敗，p53基因則引發(fā)凋亡〔3〕，使損傷的DNA不能繼續(xù)復(fù)制。p53基因突變可增加正常細(xì)胞對(duì)突變劑的敏感性，結(jié)果導(dǎo)致正常細(xì)胞癌變概率增加，使腫瘤的發(fā)病率增加。p53基因結(jié)構(gòu)和功能改變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切〔4〕。p53基因的點(diǎn)突變、變異和多態(tài)性與NPC的發(fā)病相關(guān)性研究較少，本研究結(jié)果表明CT+TT基因型與CC基因型相比，其患NPC的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。揭示本位點(diǎn)與NPC的易感性有明顯相關(guān)，說(shuō)明此位點(diǎn)是NPC發(fā)生的危險(xiǎn)因素。而且各基因型與T、N及M分期無(wú)顯著相關(guān)性。

超過(guò)50%的人類(lèi)腫瘤中有p53基因功能失活及突變，以結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌的突變最為常見(jiàn)〔5，6〕。Shirai等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)p53基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，也與胃癌的侵襲和進(jìn)展有顯著的相關(guān)性。Phang等〔8〕研究表明p53基因多態(tài)性與多種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)有顯著的相關(guān)性。Saeki等〔9〕也證實(shí)p53基因多態(tài)性與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。Liu等〔10〕發(fā)現(xiàn)p53基因相關(guān)位點(diǎn)的SNP增加了患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。Sun等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)p53基因與前列腺癌的發(fā)生與進(jìn)展有顯著的相關(guān)性。p53基因功能失活有多種方式:①p53基因的SNP突變:其中最為主要是點(diǎn)突變引起的錯(cuò)義突變，其比例約占80%左右。②被DNA腫瘤病毒蛋白失活。③被Mdm蛋白抑制。④p53基因的誤位。本實(shí)驗(yàn)研究主要針對(duì)基因點(diǎn)突變方面進(jìn)行研究，結(jié)果顯示選取的p53 rs117562731 SNP位點(diǎn)攜帶的變異等位基因在NPC組與對(duì)照組之間有顯著性差異，說(shuō)明此位點(diǎn)的突變有可能是導(dǎo)致NPC發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要因素，但其確切機(jī)制仍不清楚。

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