銀杏內(nèi)酯B對CLP誘導膿毒癥小鼠的保護作用*

王曉東，宋 兵，曾耀英△

(1暨南大學組織移植與免疫實驗中心，廣東 廣州 510632;2廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510150)

膿毒癥(sepsis)是感染導致的全身性炎癥反應綜合征，可繼發(fā)感染性休克、多器官功能障礙綜合征，是ICU(intensive care unit)病人死亡的主要原因[1]。在實驗室環(huán)境下，對嚙齒類動物進行盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)誘導的多微生物膿毒癥模型類似于腸穿孔和腸源性混合細菌感染的臨床情況，因而能夠模仿膿毒癥病人的典型病理生理變化，是一種與臨床情況有明顯相似性的理想膿毒癥模型，目前使用最為廣泛，并被視為膿毒癥研究的金標準[2－4]。近年來，血小板激活因子受體(platelet－activating factor receptor，PAFR)信號通路與炎癥、感染等疾病的關系及其在固有免疫應答中的重要作用被特別關注[5－6]，而在前面的實驗中，銀杏內(nèi)酯 B(ginkgolide B，BN52021，GB)作為 PAFR的強效拮抗劑充分體現(xiàn)了其可作為免疫調(diào)節(jié)藥物的潛質(zhì)[7－8]，于是本實驗通過進一步研究探討 GB對CLP誘導的膿毒癥小鼠的存活、外周血一氧化氮(nitric oxide，NO)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)及細胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF － α)、白細胞介素 1β(interleukin 1β，IL－1β)、IL－6和IL－10的影響來評價其對膿毒癥小鼠的保護效果。

材料和方法

1 材料

清潔級BALB/c近交系小鼠 (雄性，8～10周齡，體重25～30 g)，購自廣東省實驗動物中心。GB和二甲基亞砜購自Sigma。Griess試劑盒購自Promega。H2DCFDA購自 Invitrogen－Molecular Probes。流式細胞微球陣列(cytometric bead array，CBA)試劑盒購自BD Pharmingen。FACSCalibur流式細胞儀為Becton Dickinson產(chǎn)品。

2 方法

2.1 CLP誘導的膿毒癥小鼠模型的建立 取8～10周齡、雄性BALB/c小鼠(體重25～30 g)90只，每次30只，分為3組:sham組、CLP組和GB+CLP組，每組10只，分批進行手術。術前8 h禁食，自由飲水。術前稱重，按體重(0.015 mL/g)腹腔注射2%水合氯醛溶液逐個麻醉實施手術。使小鼠仰臥于手術臺上，固定其四肢與頭部，剃除下腹部毛并進行常規(guī)消毒。行下腹部正中皮膚縱向切口(長約1.5～2 cm)，辨識腹肌白線(即中線白色筋膜)，并于此處剖開腹肌、筋膜及腹膜層。通?？捎诟骨蛔髠?cè)找到盲腸，鈍性分離，僅游離并暴露盲腸，小腸、大腸仍留于腹腔中。由于結(jié)扎位置決定了膿毒癥的強度，本實驗采用中強級，故在盲腸基底部與其末端之間的中點處結(jié)扎，保留盲腸近端血供，用21號針頭于盲腸末端與結(jié)扎位置的中部(注意避開血管)，沿腸系膜側(cè)向其對側(cè)穿孔1次(含進針、出針各1次)，將盲腸還納回腹腔內(nèi)原位后逐層縫合。按體重皮下注射預熱的生理鹽水(0.05 mL/g)用于小鼠術后復蘇。

2.2 術前分組設計與造模標準化控制 設置對照組(sham組)、模型組(CLP組)和藥物組(GB+CLP組)。CLP組造模步驟即如上2.1項所述，sham組除取消結(jié)扎穿孔的各步之外其它操作同CLP組，GB+CLP組在術前30 min進行GB預處理，按體重腹腔注射10 μL/g濃度為1 g/L的GB溶液，則最終給藥劑量為10 μg/g，之后的造模程序與CLP組完全相同。

由于CLP誘導的膿毒癥所伴隨的炎癥反應隨其嚴重程度不同存在很大差異，從而直接影響實驗的結(jié)果及其可重復性，本實驗根據(jù)Rittirsch等[4]定義的CLP誘導膿毒癥實驗模型的標準化程序，通過保持盲腸結(jié)扎位置的一致性對造模嚴重程度進行嚴格控制，熟練手術過程，使造模時間控制在10 min以內(nèi)。在本實驗既定標準程序下，CLP模型小鼠死亡時間主要分布于術后12～48 h之間。

2.3 術后死亡率統(tǒng)計與樣本采集 CLP術后存活實驗中，每24 h記錄1次動物死亡時間并統(tǒng)計死亡率。觀察至21 d仍存活的小鼠視為存活動物，不再進行后續(xù)觀察。

體外實驗樣本采集，于術后24 h對尚存活動物逐只進行稱重、采血、解剖。摘眼球取外周血50 μL于含肝素鈉的流式管中以待ROS水平檢測;1 mL于1.5 mL EP管中靜置30 min，2000×g離心10 min，吸取200 μL上清至500 μL EP管，－20℃保存以待NO含量與細胞因子含量檢測。采血后立即處死動物進行解剖，取出胸腺和脾臟稱重。

2.4 Greiss法檢測模型小鼠血清NO含量 分別吸取sham組、CLP組和GB+CLP組血清樣本各50 μL至96孔板進行檢測，依次加入50 μL磺胺溶液及50 μL NED溶液，分別置室溫避光條件下作用5～10 min，酶標儀檢測A540值，并按近期繪制的標準品參考曲線計算NO含量。

2.5 H2DCFDA標記檢測模型小鼠外周血ROS水平向分別裝有sham組、CLP組和GB+CLP組外周血樣本的流式管中加入1 mL紅細胞裂解液，于37℃水浴8 min后，400×g離心5 min棄去上清，加入200 μL H2DCFDA 染液(終濃度 10 μmol/L)重懸細胞，避光染色30 min。而后以2 mL PBS洗滌1次，并以200 μL PBS再重懸細胞，處理后的樣本立即用FACSCalibur流式細胞儀在FL1通道進行檢測，每管樣品檢測10000個細胞。

2.6 CBA和ELISA檢測模型小鼠血清細胞因子含量 分別運用微量樣本CBA法和ELISA法檢測各細胞因子含量。(1)CBA法檢測血清TNF－α、IL－6和IL－10含量:取一系列濃度的小鼠炎癥標準品稀釋液和待測血清樣本各50 μL于流式管，加入50 μL 3種捕獲微球 (capture beads，分別偶聯(lián)TNF－α、IL－6和IL－10的特異抗體)的混合懸液，加入50 μL PE檢測試劑 (detection reagent，偶聯(lián) TNF－α、IL－6和IL－10的特異抗體)，室溫避光孵育2 h。此間，用陰性對照、FITC陽性對照和PE陽性對照，根據(jù)設置程序提示，分別設置流式細胞儀電壓和補償。孵育完成后，用1 mL洗滌緩沖液洗1次(200×g離心5 min)，300 μL洗滌緩沖液重懸，并用流式細胞儀進行檢測分析[9]。3種捕獲微球的分離熒光在FL3通道檢測，PE檢測試劑的熒光在FL2通道檢測，在FL2 vs FL3散點圖中對不同細胞因子進行分析。最后，繪制標準曲線，并求得相應細胞因子含量。(2)ELISA法檢測血清IL－1β含量:取標準品與血清樣本各100 μL至96孔微量反應板，覆蓋反應孔，室溫孵育2.5 h，棄去孔內(nèi)液體并洗滌4次(每次洗滌加300 μL洗滌緩沖液，洗畢完全去除液體殘留);加入100 μL生物素化的IL－1β抗體溶液，室溫輕搖孵育1 h，棄去液體并重復洗滌步驟;加入100 μL HRP－鏈霉親和素溶液，室溫輕搖孵育45 min，棄去液體并重復洗滌步驟;加入100 μL TMB一步化底物試劑，室溫避光輕搖孵育30 min;加入50 μL終止液，并立即在酶標儀檢測其A450值。繪制標準曲線，并計算血清樣本中IL－1β含量。

3 統(tǒng)計學處理

FACSCalibur流式細胞儀數(shù)據(jù)由CELLQuest軟件獲取并用FlowJo 7.0進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，并應用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計學分析與作圖，組間差異用單因素方差分析比較，n為平行實驗次數(shù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 GB預處理延長CLP模型小鼠的存活

存活實驗每組樣本量為20只，統(tǒng)計存活率與死亡率結(jié)果表明，sham組小鼠術后全部存活，無一死亡;CLP組小鼠于術后5 d內(nèi)全部死亡，且首日死亡率高達65%;術前30 min進行GB預處理能顯著改善CLP小鼠的存活情況，GB－CLP組小鼠首日死亡率較CLP組降低30%，且最終有30%小鼠存活至術后7 d，之后不再死亡，見圖1。

2 GB預處理緩解CLP模型小鼠胸腺和脾臟的萎縮

計算并比較各組小鼠的胸脾指數(shù)，胸腺指數(shù)(thymus index)或脾臟指數(shù)(spleen index)=胸腺或脾臟的質(zhì)量/體重×1000。結(jié)果表明，CLP手術后，胸脾指數(shù)較sham組皆有顯著下降，即胸腺與脾臟萎縮明顯，而GB預處理可以保護小鼠的這2個重要的免疫器官，有效緩解胸腺和脾臟萎縮進程，見圖2。

Figure1.Survival rate of mice within 3 weeks after surgery.圖1 術后3周內(nèi)小鼠的存活情況

Figure2.Thymus and spleen indexes 24 h after surgery..n=5.##P ＜ 0.01 vs sham group;*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs CLP group.圖2 術后24 h的胸脾指數(shù)

3 GB預處理降低CLP小鼠血清NO含量

CLP手術后24 h，CLP組小鼠血清NO含量較sham組有明顯上升，其濃度從 (11.000 ±1.515)μmol/L上升至 (19.990 ± 3.240)μmol/L(P ＜0.01);而GB預處理可以有效抑制CLP誘導膿毒癥小鼠的NO產(chǎn)生，NO濃度降至 (14.939 ±1.603)μmol/L(P ＜0.05)。

4 GB預處理降低CLP小鼠外周血ROS水平

以ROS探針H2DCFDA的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)反映外周血ROS的水平，結(jié)果見圖3，術后24 h，sham組小鼠外周血ROS水平相對較低;CLP組小鼠經(jīng)CLP誘導膿毒癥后外周血ROS水平有顯著上升(P＜0.01);而GB+CLP組小鼠由于術前進行了GB預處理，顯著抑制了CLP手術導致的外周血ROS水平上升(P＜0.05)。

5 GB預處理降低CLP小鼠血清TNF－α、IL－1β、IL－6和IL－10的含量

Figure3.ROS level in peripheral blood 24 h after surgery..n=5.##P＜0.01 vs sham group;*P＜0.05 vs CLP group.圖3 術后24 h外周血ROS水平

Figure4.Serum cytokine concentration 24 h after surgery..n=5.#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CLP group.圖4 術后24 h血清細胞因子含量

如圖4所示，CLP手術后24 h，sham組小鼠血清TNF－α、IL－1β、IL－6和 IL－10含量均較低;CLP組小鼠經(jīng)CLP誘導膿毒癥后，TNF－α、IL－1β、IL－6和IL－10較sham組均有明顯上升;其中尤以IL－10升幅最為顯著;而GB+CLP組小鼠由于GB預處理的作用，有效抑制了CLP誘導膿毒癥小鼠的炎性細胞因子風暴，其中TNF－α、IL－6和IL－10均顯著降低，其中尤以IL－10降幅最為明顯，而IL－1β較CLP組雖有所下降，但無統(tǒng)計學意義。

討 論

膿毒癥因其能導致高致死率的感染性休克及多器官衰竭，仍然是科學家們和臨床醫(yī)生們的主要挑戰(zhàn)，然而實驗設置所假定的模式在臨床實踐中卻并不適用，這就需要一種能夠重現(xiàn)膿毒癥病人感染性休克相關的病理生理變化的動物模型用來確定新的治療藥物[1]。

嚙齒類動物CLP的實驗模型類似于腸穿孔和腸源性混合細菌感染的臨床情況，已被開發(fā)了30多年，無疑是一種與臨床情況有明顯相似性的目前最理想的膿毒癥模型[2－3]。然而，由于 CLP造模所致的炎癥反應與存活情況隨膿毒癥的嚴重程度差異很大，因此只有以標準化的統(tǒng)一方式進行造模才能使膿毒癥模型保持較高一致性，不至影響實驗結(jié)果，而標準化盲腸結(jié)扎長度是設計實驗膿毒癥嚴重程度的一種可靠且可重復的工具[4]。本實驗正是應用該標準化程序設計了中強級膿毒癥模型，結(jié)果施以CLP手術的小鼠于術后前幾日全部死亡，而我們驚喜地發(fā)現(xiàn)，若在術前進行GB預處理，則能大大降低其死亡率，顯著改善膿毒癥小鼠的存活情況。

組織炎癥與抗炎反應的平衡可使活化的中性粒細胞和其它效應細胞聚集在感染區(qū)域，同時防止遠隔的器官受損，而膿毒癥則是一種全身性炎癥與抗炎反應失衡的炎癥反應[10]。膿毒癥的病理情況正是由以 ROS、活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)和炎癥細胞因子的大量產(chǎn)生為特征的、過度的防御反應和炎癥反應所致[10]，這些過量的炎癥介質(zhì)是由巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞及內(nèi)皮細胞產(chǎn)生并釋放。我們之前于體外研究中發(fā)現(xiàn)，GB能下調(diào)LPS活化的巨噬細胞產(chǎn)生NO和ROS的水平[8]，本實驗進一步在CLP誘導的膿毒癥模型中驗證GB下調(diào)ROS、RNS的效用，發(fā)現(xiàn)GB預處理可以顯著降低膿毒癥小鼠外周血NO和ROS的水平，與體外實驗結(jié)果一致。

全身性炎癥反應是嚴重膿毒癥的首要致病事件，在實驗動物模型和臨床膿毒癥中，大量細菌化合物引發(fā)細胞因子與趨化因子的過量產(chǎn)生和釋放，高水平的炎癥細胞因子涉及多器官障礙和感染性休克的發(fā)展[11－13]。據(jù)報道，在膿毒癥期間 TNF － α、IL －1β、IL－6和 IL－10等細胞因子的濃度均會升高[11]。其中TNF－α和IL－1β的協(xié)同作用被喻為是細胞因子誘發(fā)病理生理級聯(lián)反應的扳機，IL－6也無疑是膿毒癥嚴重程度預后的一個重要指標;而抗炎細胞因子IL－10，雖然一些研究表明它與TNF－α、IL－1β、IL－6等致炎細胞因子同時產(chǎn)生會拮抗后三者的致炎作用，但是在膿毒癥中抗炎細胞因子占據(jù)主導地位與感染的嚴重程度增加相關，結(jié)果反而增加了器官損害和死亡率[12]。實際上，IL－10血漿濃度的持續(xù)高水平只發(fā)生在死亡的患者中，幸存者則顯著降低。因此，促炎介質(zhì)和抗炎介質(zhì)失調(diào)與膿毒癥的嚴重程度和致死率有關[13]。我們的結(jié)果表明，在CLP組中，血清 TNF－α、IL－1β、IL－6和 IL－10的水平均失控性地升高，并且GB預處理顯著降低了這些細胞因子水平。

據(jù)報道，在嚴重膿毒癥中，可使PAF失活的PAF乙酰水解酶減少[14]，而PAFR拮抗藥能改善實驗膿毒癥的致命效應[15－16]，這些發(fā)現(xiàn)證實了PAFR信號通路是致死性膿毒癥期間全身性炎癥演化的重要決定因素，并暗示了阻斷PAFR信號轉(zhuǎn)導可能降低致死率，是治療膿毒癥合適的策略。然而臨床實驗中，重組人PAFR乙酰水解酶和PAFR拮抗劑均不能降低嚴重膿毒癥病人的死亡率[14－16]。我們的研究結(jié)果為PAFR拮抗劑在實驗中有效而在臨床實驗中無效的明顯矛盾提供了一種有趣的可能的解釋。在臨床試驗中，對病人的治療始于感染性休克綜合癥已發(fā)，而此時，炎癥細胞因子及ROS、RNS已經(jīng)過量，巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞的行為、功能障礙也已形成。與上述研究相似的是，在本研究的預實驗階段，當我們將PAFR天然拮抗劑GB用于術后處理也鮮有保護作用，而當我們將GB用于術前預處理，卻能明顯降低外周血炎癥細胞因子TNF－α、IL－1β、IL－6和IL－10及炎癥介質(zhì)NO、ROS水平，從而抑制細菌擴散和全身性炎癥反應綜合癥的發(fā)生發(fā)展。然而，本實驗所采用的術前給藥方式與臨床實際情況存在較大差距，故而GB作為用于膿毒癥與感染性休克早期免疫治療的潛在藥物該如何應用于臨床尚待進一步研究。

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