肥胖引起的線粒體功能及抗氧化異常促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞排卵后老化*

李俐琳，任 姿，曾海濤，方 叢

(1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 510000;2廣東省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 510080，3中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510630)

隨著生活水平的提高及生活方式的改變，全球肥胖癥發(fā)生率迅速增加，并呈年輕化趨勢(shì)。肥胖在多個(gè)方面影響著人類的生殖健康[1－2]。多數(shù)肥胖婦女存在與排卵異常相關(guān)的不孕癥。另一方面，肥胖患者卵子內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝也出現(xiàn)異常改變，對(duì)卵子質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。即使是進(jìn)行輔助生育治療的人群，肥胖患者促排卵時(shí)間、促性腺激素的使用量及因反應(yīng)不良的周期取消率均增加，而獲卵數(shù)目減少，此外肥胖可增加流產(chǎn)及多種產(chǎn)科合并癥的發(fā)病率 [1－2]。

排卵后不及時(shí)受精，卵母細(xì)胞的生理生化反應(yīng)活性將顯著降低，這一現(xiàn)象稱為卵母細(xì)胞的老化。卵母細(xì)胞老化表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡失調(diào)、皮質(zhì)顆粒外排、微管丟失、染色體不對(duì)稱和松散分布、線粒體膜電位降低和基質(zhì)膨脹等變化，是胚胎發(fā)育能力低下和早期流產(chǎn)的主要原因之一[3]。肥胖引起組織細(xì)胞代謝紊亂[4]，導(dǎo)致ATP生成減少，機(jī)體活性氧類(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多和(或)機(jī)體抗氧化能力下降，谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平降低;ROS清除不足，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)增多并引起細(xì)胞氧化損傷的病理過程。這些提示肥胖患者卵母細(xì)胞存在能量和ROS代謝異常，導(dǎo)致排卵后卵母細(xì)胞老化加速，引起受孕能力減低，流產(chǎn)率增高[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究肥胖對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)老化、體外受精和胚胎發(fā)育的影響及可能機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物及主要試劑

動(dòng)物DBA雄鼠和C57BL/6雌鼠購自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，B6D2F1(C57BL/6*DBA)小鼠在本實(shí)驗(yàn)室繁殖獲得。14周大小B6D2F1雌鼠隨機(jī)分成2組，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組每天自由采食高脂飼料[6]，肥胖小鼠建模成功標(biāo)準(zhǔn)為:與正常飼養(yǎng)對(duì)照組比較，體重增加大于20%被認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型建立成功。孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)購自寧波制藥廠，2'，7'－ 二氯二氫熒光素二乙酸酯(2'，7'－ dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH －DA)購自 Molecular Probe，ATP和GSH檢測(cè)試劑盒購自Promega，細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒購自碧云天，其它試劑購自Sigma。采用HEPES－CZB液收集卵母細(xì)胞，CZB－G培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用Vitro Research Media series(Cook Medical)進(jìn)行體外受精和胚胎培養(yǎng)。

2 卵母細(xì)胞的收集及體外培養(yǎng)

B6D2F1雌鼠每只腹腔注射10 IU PMSG，48 h后腹腔注射10 IU HCG。分別于注射HCG 14、18和22 h后后斷頸處死小鼠，收集輸卵管中卵母細(xì)胞－卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合體。

3 卵丘顆粒細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

采用Hoechst 33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染的方法。實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書進(jìn)行，使用LSM－510激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。

4 卵母細(xì)胞線粒體膜電位和ROS的檢測(cè)

采用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物，5，5'，6，6'－ tetrachloro － 1，1'，3，3'－ tetraethyl benzimidalyl carbocyanine iodide，JC－1)檢查卵母細(xì)胞的線粒體膜電位。JC－1用DMSO溶解成1 mmol/L分裝－20℃凍存，去除顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞在37℃含1 μmol/L JC－1的培養(yǎng)液中培養(yǎng)15 min后進(jìn)行檢測(cè)。采用LSM－510激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，紅色熒光強(qiáng)度/綠色熒光強(qiáng)度的比值反映出線粒體的活性。去除顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞在37℃、含10 μmol/L DCFH－DA的培養(yǎng)液中培養(yǎng)30 min后檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平。

5 卵母細(xì)胞ATP和GSH含量的檢測(cè)

采用透明質(zhì)酸酶去除顆粒細(xì)胞后，使用PBS收集卵母細(xì)胞，10 個(gè)卵母細(xì)胞∶10 μL PBS、50 個(gè)卵母細(xì)胞∶10 μL PBS分別用于檢測(cè)卵母細(xì)胞中ATP和GSH水平，液氮中迅速冷凍后置于－80℃凍存。檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行。

6 體外受精和胚胎培養(yǎng)

將成熟卵母細(xì)胞放入受精培養(yǎng)液中受精，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，采用DAPI染色，如觀察到有2個(gè)原核形成，并在卵周隙可看到1條精子尾，認(rèn)為是正常受精。將正常受精卵再?zèng)_洗3次，移入用礦物油覆蓋的、已平衡的20 μL胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，于第1 d和第5 d分別觀察卵裂和囊胚形成。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間差異采用方差分析及卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肥胖對(duì)排卵后卵丘顆粒細(xì)胞凋亡的影響

表1和圖1A～F顯示，注射HCG后，對(duì)照組和肥胖者的卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡率無差別(P＞0.05);注射HCG后18 h較注射HCG后14 h，2組卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P＜0.05)，其中肥胖組小鼠較對(duì)照組卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡率增加顯著(P＜0.05);注射HCG后22 h較注射HCG后18 h，2組卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡率均顯著增加(P＜0.05)，其中肥胖組小鼠較對(duì)照組卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡率增加更加明顯(P＜0.05)，幾乎達(dá)到后者的2倍。

表1 肥胖對(duì)排卵后卵丘顆粒細(xì)胞凋亡的影響Table1.The effect of obesity on the apoptosis of postovulatory cumulus cells(.n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs the same group at 14 h;△P＜0.05 vs the same group at 18 h.

Time(h) Group Apoptotic rate(%)14 Control 5.53 ±0.97 Obesity 6.91 ±1.0318 Control 7.19 ±1.72#Obesity 10.84 ±2.89*#22 Control 11.37 ±2.79△Obesity 18.50 ±3.86＊△

Figure1.Detection of apoptosis of cumulus cells，and mitochondrial membrane potential(MMP)and reactive oxygen species(ROS)levels in oocytes.A ～F:the cumulus－oocyte complexes(COCs)were stained by Hoechst 33342 and propidium iodide(PI).Cells with intact membrane fluoresced blue，whereas those with damaged membrane fluoresced red.G ～L:the potential－sensitive fluorescence dye JC－1 was used to measure the MMP.High MMP showed yellow－red fluorescence and the low one showed green fluorescence.M ～R:the COCs were stained by DCFH－DA for the ROS assay.圖1 卵丘顆粒細(xì)胞凋亡、卵母細(xì)胞中線粒體膜電位和ROS水平的檢測(cè)

2 肥胖對(duì)排卵后卵母細(xì)胞線粒體功能的影響

表2和圖1G～L顯示，注射HCG后14 h，卵母細(xì)胞線粒體膜電位及ATP含量在對(duì)照組和肥胖組均無顯著差異(P＞0.05);注射HCG后18 h較注射HCG后14 h，2組卵母細(xì)胞線粒體膜電位無差別，但肥胖組卵母細(xì)胞中ATP含量顯著降低(P＜0.05)，其中肥胖組小鼠卵母細(xì)胞中ATP含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);注射HCG后22 h較注射HCG后18 h，2組卵母細(xì)胞線粒體膜電位及ATP含量均進(jìn)一步顯著降低(P＜0.05)，其中肥胖組小鼠較對(duì)照組卵母細(xì)胞線粒體膜電位及ATP含量下降更加明顯(P＜0.05)。

表2 肥胖對(duì)排卵后老化卵母細(xì)胞線粒體膜電位及ATP含量的影響Table2.The effect of obesity on mitochondrial membrane potential(MMP)and ATP content in postovulatory aging mouse oocytes(.n=3)

表2 肥胖對(duì)排卵后老化卵母細(xì)胞線粒體膜電位及ATP含量的影響Table2.The effect of obesity on mitochondrial membrane potential(MMP)and ATP content in postovulatory aging mouse oocytes(.n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs the same group at 14 h;△P ＜0.05 vs the same group at 18 h.

Time(h)Group MMP(red fluorescence/green fluorescence)ATP content(pmol/cell)14 Control 0.47 ±0.09 1.13 ±0.27 Obesity 0.44 ±0.12 1.17 ±0.2518 Control 0.48 ±0.11 1.16 ±0.22 Obesity 0.43 ±0.13 1.04 ±0.19*#22 Control 0.42 ±0.11△ 0.92 ±0.19△Obesity 0.35 ±0.12＊△ 0.83 ±0.26＊△

3 肥胖對(duì)排卵后卵母細(xì)胞ROS和GSH生成的影響

表3和圖1M～R顯示，注射HCG后14 h，對(duì)照組和肥胖組ROS水平無差別(P＞0.05)，肥胖組卵母細(xì)胞中GSH的水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);注射HCG后18 h較注射HCG后14 h，對(duì)照組卵母細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH的水平無變化，而肥胖組卵母細(xì)胞內(nèi)ROS的水平開始明顯升高(P＜0.05)，GSH的水平顯著降低(P＜0.05);注射HCG后22 h較注射HCG后18 h，2組卵母細(xì)胞ROS和GSH的含量均進(jìn)一步顯著降低(P＜0.05)，其中和對(duì)照組比較，肥胖組小鼠卵母細(xì)胞ROS的水平升高更加明顯(P＜0.05)，GSH的水平降低更加明顯(P＜0.05)。

4 肥胖對(duì)排卵后卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育的影響

表4顯示，注射HCG 14 h后，對(duì)照組和肥胖組的二細(xì)胞胚胎、囊胚形成率及囊胚細(xì)胞數(shù)均無顯著差別(P＞0.05);注射HCG后18 h，對(duì)照組和肥胖組的二細(xì)胞胚胎和囊胚形成率均無顯著差別(P＞0.05)，而肥胖組囊胚的細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，較注射HCG后14 h，肥胖組囊胚的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05);注射HCG后22 h，肥胖組囊胚的二細(xì)胞胚胎和囊胚形成率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，較注射HCG后18 h，2組卵母細(xì)胞二細(xì)胞胚胎和囊胚形成率均顯著降低(P＜0.05)。

表3 肥胖對(duì)排卵后老化卵母細(xì)胞ROS和GSH含量的影響Table3.The effect of obesity on ROS and GSH content in postovulatory aging mouse oocytes(.n=3)

表3 肥胖對(duì)排卵后老化卵母細(xì)胞ROS和GSH含量的影響Table3.The effect of obesity on ROS and GSH content in postovulatory aging mouse oocytes(.n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs the same group at 14 h;△P ＜0.05 vs the same group at 18 h.

Time(h)Group Relative fluorescenceGSH content intensity of ROS(pmol/cell)14 Control 1.00 ±0.26 1.66 ±0.37 Obesity 1.07 ±0.31 1.47 ±0.41*18 Control 0.97 ±0.29 1.58 ±0.35 Obesity 1.23 ±0.35*# 1.24 ±0.29*#22 Control 1.22 ±0.37△ 1.21 ±0.32△Obesity 1.69 ±0.52＊△ 0.76 ±0.24＊△

表4 肥胖對(duì)排卵后老化小鼠卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育的影響Table4.The effect of obesity on embryonic development competence of postovulatory aging mouse oocytes fertilized in vitro(.n=3)

表4 肥胖對(duì)排卵后老化小鼠卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育的影響Table4.The effect of obesity on embryonic development competence of postovulatory aging mouse oocytes fertilized in vitro(.n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs the same group at 14 h;△P ＜0.05 vs the same group at 18 h.

TimeGroup Two－cell embryoBlastocystCell number of(h) formation rateblastocyst(%)(%)14 Control 96.1 85.7 61.8 ±8.4 Obesity 92.9 81.1 58.4 ±9.718 Control 94.6 83.9 64.7 ±8.9 Obesity 91.8 80.5 52.5 ±9.2*#22 Control 88.4△ 72.6△ 53.7±7.7△Obesity 76.3＊△ 57.4*49.3±9.5

討 論

營(yíng)養(yǎng)性肥胖會(huì)影響女性生殖功能，降低受孕率。我們的研究表明，營(yíng)養(yǎng)性肥胖促進(jìn)小鼠排卵后的卵母細(xì)胞老化，卵母細(xì)胞受精及卵裂能力下降，其胚胎發(fā)育潛能明顯降低，而對(duì)剛排卵的卵母細(xì)胞的胚胎發(fā)育潛能影響較小。這提示可能在體內(nèi)，卵母細(xì)胞排出后，如未在排卵后4 h內(nèi)受精，其胚胎質(zhì)量較低，可能是營(yíng)養(yǎng)性肥胖會(huì)影響女性生殖功能的主要原因。小鼠卵母細(xì)胞老化后進(jìn)行體外受精，其受精率和胚胎發(fā)育率均降低。其它研究發(fā)現(xiàn)豬卵母細(xì)胞老化12 h受精率顯著下降，異常受精率增加。對(duì)老化的豬卵母細(xì)胞核移植發(fā)現(xiàn)，激活1～2 h內(nèi)核膜破裂率下降，囊胚數(shù)目減少[8]。小鼠類似的研究也證實(shí)了老化卵母細(xì)胞核移植后囊胚形成率明顯降低[3，7]。

卵母細(xì)胞的老化是一個(gè)復(fù)雜的生理過程[3]。ROS是有氧代謝的產(chǎn)物，正常情況下ROS的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡[9]，當(dāng)這種平衡破壞而ROS過多時(shí)，就會(huì)影響卵母細(xì)胞成熟、受精、胚胎發(fā)育和妊娠等一系列生理過程[3]。我們的研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠卵母細(xì)胞在體外老化的進(jìn)程加快，細(xì)胞中ROS的水平在HCG注射后18 h就顯著增加，而正常對(duì)照小鼠卵母細(xì)胞ROS在HCG注射后22 h才明顯增加，而同時(shí)小鼠卵母細(xì)胞體外受精和胚胎發(fā)育潛能顯著下降。其它研究用過氧化物處理新鮮和老化的卵母細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)老化卵母細(xì)胞表現(xiàn)出高頻率、低振幅的Ca2+波動(dòng)，較低的受精率和囊胚率以及較高的胚胎碎片比例[3]。新鮮卵母細(xì)胞在低濃度H2O2下能加速老化進(jìn)程[10]。

近年來研究表明線粒體內(nèi)膜電位的下降，是凋亡發(fā)生的早期事件[11]。van Blerkom 等[12]證實(shí)，成熟卵的線粒體膜電位與年齡呈負(fù)相關(guān)，其胚胎發(fā)育潛力也隨之降低。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)未成熟卵的線粒體膜電位低，而成熟卵的線粒體膜電位高，且均勻分布在整個(gè)胞質(zhì)[13]。發(fā)育潛能差的胚胎線粒體活性比發(fā)育潛能好的低，說明線粒體在卵和胚胎早期發(fā)育中起著重要的作用[12，14]。本研究結(jié)果顯示，線粒體膜電位與卵母細(xì)胞的質(zhì)量密切相關(guān)，與囊胚形成率呈正相關(guān)，提示卵母細(xì)胞線粒體內(nèi)膜的完整性影響卵母細(xì)胞及胚胎的體外發(fā)育潛能。隨著卵母細(xì)胞的老化，高濃度的活性氧對(duì)線粒體造成損傷，參與ATP代謝的相關(guān)基因表達(dá)水平下降，降低了產(chǎn)生ATP的能力[12]。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，卵母細(xì)胞中ROS水平升高的同時(shí)，ATP的含量明顯減少，其發(fā)育到囊胚的數(shù)減少。此外，其它研究還發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞中ATP含量的減少會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成和其它功能[12]。GSH在卵母細(xì)胞中的主要功能是通過巰基基團(tuán)參與抗氧化作用和抵抗ROS毒害作用來保護(hù)卵母細(xì)胞[15]。我們的研究也提示GSH濃度的高低對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和受精是非常重要的，卵母細(xì)胞成熟期間GSH的積累能提高卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟質(zhì)量，保護(hù)卵母細(xì)胞在受精后的胚胎發(fā)育階段免受氧化損傷。

在肥胖誘導(dǎo)機(jī)體胰島素抵抗、細(xì)胞能量代謝和抗氧化作用中，線粒體對(duì)脂肪酸的清除作用至關(guān)重要[16]。胞漿脂肪酸水平的進(jìn)一步升高將導(dǎo)致線粒體功能障礙，同時(shí)細(xì)胞線粒體密度下降，ATP生成均明顯減少。此外，肥胖患者細(xì)胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降。SOD作為機(jī)體內(nèi)最廣泛存在的一類金屬抗氧化酶[17]，能催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)。因此細(xì)胞清除生命活動(dòng)中產(chǎn)生的超氧離子的能力下降，ROS水平增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。卵丘顆粒細(xì)胞是環(huán)繞在卵母細(xì)胞外的一種特殊體細(xì)胞，不僅在卵母細(xì)胞成熟、排卵和受精過程中有重要作用，而且對(duì)卵母細(xì)胞的老化也有影響[3]。我們的研究發(fā)現(xiàn)卵丘顆粒細(xì)胞在排卵后凋亡率逐漸增加，肥胖促進(jìn)其凋亡發(fā)生。當(dāng)機(jī)體存在肥胖的病理狀態(tài)，顆粒細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激代償能力下降，抗氧化物質(zhì)GSH等生成減少，同時(shí)自身大量的ROS釋放入卵泡液中，嚴(yán)重影響了卵子的發(fā)育成熟[3]?？梢酝茰y(cè)，肥胖卵丘顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激降低了卵子的受精能力，導(dǎo)致了后續(xù)胚胎發(fā)育不佳。如前所述，顆粒細(xì)胞自身狀態(tài)對(duì)卵子的發(fā)育影響較大。在肥胖的異?？寡趸癄顟B(tài)下，顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的過量ROS可直接導(dǎo)致自身凋亡，使得卵子失去顆粒細(xì)胞的保護(hù)及其它調(diào)節(jié)功能，進(jìn)而損害卵子的發(fā)育。因此我們認(rèn)為顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激可通過凋亡影響卵子質(zhì)量。除此之外，氧化應(yīng)激還可能直接損害卵子質(zhì)量。

本研究結(jié)果初步顯示肥胖促進(jìn)排卵后卵母細(xì)胞的老化，氧自由基對(duì)卵母細(xì)胞的損傷可能是引起母源老化不孕的重要原因。在對(duì)肥胖患者進(jìn)行生殖健康宣教時(shí)，應(yīng)突出在醫(yī)生的指導(dǎo)下進(jìn)行安全而有效的減肥和助孕治療，把握排卵時(shí)機(jī)，選擇排卵早期進(jìn)行受精，避免卵子排卵后老化的影響，以提高受孕幾率，減少流產(chǎn)發(fā)生。

[1]Moran LJ，Dodd J，Nisenblat V，et al.Obesity and reproductive dysfunction in women[J].Endocrinol Metab Clin North Am，2011，40(4):895－906.

[2]Ogbuji QC.Obesity and reproductive performance in women[J].Afr J Reprod Health，2010，14(3):143 －151.

[3]Miao YL，Kikuchi K，Sun QY，et al.Oocyte aging:cellular and molecular changes，developmental potential and reversal possibility[J].Hum Reprod Update，2009，15(5):573－585.

[4]Lumeng CN，Saltiel AR.Inflammatory links between obesity and metabolic disease[J].J Clin Invest，2011，121(6):2111－2117.

[5]Selesniemi K，Lee HJ，Muhlhauser A，et al.Prevention of maternal aging－associated oocyte aneuploidy and meiotic spindle defects in mice by dietary and genetic strategies[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(30):12319 －12324.

[6]Glendinning JI，Breinager L，Kyrillou E，et al.Differential effects of sucrose and fructose on dietary obesity in four mouse strains[J].Physiol Behav，2010，101(3):331 －343.

[7]張國(guó)敏，周崢嶸，孫紅艷，等.哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞老化機(jī)制的研究進(jìn)展[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，33(1):9－13.

[8]Iwamoto M，Onishi A，F(xiàn)uchimoto D，et al.Effects of caffeine treatment on aged porcine oocytes:parthenogenetic activation ability，chromosome condensation and development to the blastocyst stage after somatic cell nuclear transfer[J].Zygote，2005，13(4):335 －345.

[9]吳建宇，王淑秋，王柏欣，等.實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠心肌線粒體的氧自由基損傷[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(2):233－237.

[10]Goud AP，Goud PT，Diamond MP，et al.Reactive oxygen species and oocyte aging:role of superoxide，hydrogen peroxide，and hypochlorous acid[J].Free Radic Biol Med，2008，44(7):1295－1304.

[11]陳夢(mèng)飛，陸大祥，戚仁斌，等.甘氨酸脂質(zhì)體對(duì)心肌細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2008，24(7):1254－1258.

[12]van Blerkom J.Mitochondrial function in the human oo-cyte and embryo and their role in developmental competence[J].Mitochondrion，2011，11(5):797 －813.

[13]Zeng HT，Yeung WS，Cheung MP，et al.In vitro－matured rat oocytes have low mitochondrial deoxyribonucleic acid and adenosine triphosphate contents and have abnormal mitochondrial redistribution[J].Fertil Steril，2009，91(3):900－907.

[14]Zeng HT，Ren Z，Yeung WS，et al.Low mitochondrial DNA and ATP contents contribute to the absence of birefringent spindle imaged with PolScope in in vitro matured human oocytes[J].Hum Reprod，2007，22(6):1681 －1686.

[15]Hao ZD，Liu S，Wu Y，et al.Abnormal changes in mitochondria，lipid droplets，ATP and glutathione content，and Ca2+release after electro－activation contribute to poor developmental competence of porcine oocyte during in vitro ageing[J].Reprod Fertil Dev，2009，21(2):323 －332.

[16]Fresno M，Alvarez R，Cuesta N.Toll－like receptors，inflammation，metabolism and obesity[J].Arch Physiol Biochem，2011，117(3):151－164.

[17]Guo J，Chen Y，Yuan B，et al.Effects of intracellular superoxide removal at acupoints with TAT－SOD on obesity[J].Free Radic Biol Med，2011，51(12):2185 －2189.