福建省商業(yè)豬種MUC13、IGF2和RYR1基因主效位點的遺傳變異分析

阮國榮，肖石軍，徐 盼，劉亞軒，陳金雄，江宵兵

(1．福建農業(yè)職業(yè)技術學院，福建 福州 350119;2．江西農業(yè)大學 動物生物技術國家重點實驗室培育基地，江西南昌 330045;3．福建光華百斯特生態(tài)農牧有限公司，福建 尤溪 365100;4．福建省畜牧畜醫(yī)總站，福建 福州 350003)

隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化、專業(yè)化水平的不斷提高，培育杜洛克、長白、大白等主流商業(yè)品種內各具特色的專門化新品系，通過配合力測定建立配套系已成為世界種豬業(yè)發(fā)展的主導方向，國際大型豬育種公司都已把培育多元化品系作為應變未來不同市場需求的策略。鑒別和應用重要經濟性狀的主效基因或分子標記，建立分子標記聚合育種、全基因組選擇等新型高效育種手段，結合常規(guī)育種技術，以配套系的形式持續(xù)選育提高引進商業(yè)豬種，是未來我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的必由之路［1－3］。

本研究選擇3個對養(yǎng)豬生產具有顯著影響的主效基因位點，包括決定新生仔豬產腸毒素大腸桿菌(ETEC)F4ac腹瀉易感性的MUC13基因［4］，影響生長速度和背膘厚的類胰島素生長樣因子2(IGF2)基因內含子3 g．3072G＞A突變［5－9］，決定氟烷敏感抗性的蘭定尼受體1(RYR1)基因 c．1843 C＞T位點［10－11］，采用PCR-RFLP或PCR-SNaPshot方法，在福建廈門、福清、三明、龍巖等6家大型種豬場的杜洛克、長白、大白等引進豬種核心育種群中，對MUC13、IGF2和RYR1基因主效突變位點進行檢測，應用于各豬場核心群的選育改良，以期降低豬群的腹瀉發(fā)病率，提高豬產肉量，剔除氟烷應激敏感基因。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

實驗動物來自福建光華百斯特生態(tài)農牧發(fā)展有限公司、廈門國壽種豬開發(fā)有限公司、福建永誠畜牧有限公司、龍巖市龍馬畜牧飼料有限公司種豬場、龍巖市萬龍原種豬發(fā)展有限公司、龍巖市晨興養(yǎng)殖有限公司等6家種豬場。樣本總數1 879頭，其中杜洛克629頭，長白627頭，大白623頭。采樣時將待檢測豬的耳尖用酒精消毒后，用耳號鉗剪取耳組織樣品2～3 g，放入盛有體積分數為75%酒精的1．5 mL Eppendorf管內，低溫保存。采用常規(guī)的苯酚/氯仿/異戊醇法提取基因組DNA，統(tǒng)一稀釋至20 ng/μL。

1．2 基因型判定

PCR引物由上海生工生物有限公司合成。各主效基因位點的引物序列及其判型方法見表1。PCR反應體系總體積為 20 μL，包括模板 DNA 40 ng，10 × buffer 2．0 μL，25 mmol/LMgCl21．2 μL，10 mmol/L dNTP 0．3 μL，Fp 0．4 μL，Rp 0．4 μL，Taq 聚合酶 0．5 μL，超純水 13．2 μL。PCR 循環(huán)參數:94℃變性3 min，94℃ 30 s，退火溫度(表1)30 s，72℃延伸45 s，共36個循環(huán)。

表1 PCR引物及其判型方法Tab．1 PCR primer and genotyping methed

1．2．1 PCR－SNaPshot法 采用PCR-SNaPshot判定MUC13和IGF2基因型，反應體系為5 μL，包含1．5 μL 純化后PCR 產物，2 μL SNaPshot multiplexmix(含Taq聚合酶和熒光標記的dd －NTPs)，1．2 μL 去離子水，0．3 μL SNaPshot引物。SNaPshot反應體系的擴增程序為:96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，25個循環(huán)。然后，在SNaPshot反應產物中加0．57 μL 1 × NEB buffer和0．1 μL的CIP純化酶，37℃反應60 min以清除熒光標記的ddNTPs，隨后75℃反應15 min滅活純化酶。最后，每1 μL SNaPshot反應產物加8 μL Hi-Di formamide與GeneScan 120 LiZ size standard混合物(兩者比例為20∶1)，經變性后上樣于 ABI 3130XL 遺傳分析儀(ABI，USA)進行電泳，利用 GeneMapper Software version 4．0(ABI，USA)進行基因型判定和數據收集。

1．2．2 PCR－RFLP法 利用 Hha I PCR-RFLP法檢測 RYR1．c．1843 C＞T位點的基因型，PCRRFLP檢測酶切反應體系及條件為:PCR產物6 μL，Hha I內切酶1U(NEB，英國)，酶切緩沖液1．5 μL，加水至總體積為15 μL。37℃水浴4 h以上或過夜。當RYR1基因型為NN時，Hha I可將PCR擴增的659 bp特異片段酶切成493 bp和166 bp兩條帶;當HAL基因型為nn時，HhaI限制酶識別位點消失，電泳后只有659 bp 1條帶;當HAL基因型為Nn時，可以觀察到659 bp、493 bp、166 bp 3條帶。

2 結果與分析

2．1 MUC13基因的基因頻率和基因型頻率

各品種的MUC13基因型頻率及基因頻率的分布見表2。結果表明，各品種均有一定程度的有利等位基因，杜洛克有利(抗性)等位基因頻率最高，達0．892。

表2 各品種MUC13基因的基因型頻率和基因頻率Tab．2 The genotype and allele frequency of MUC13 in the tested breed

2．2 IGF2基因的基因頻率和基因型頻率

各品種IGF2 intro3 g．3072G＞A基因型頻率及基因頻率的分布見表3。結果表明:杜洛克群體有利基因頻率為0．933，A等位基因在杜洛克中已基本純合，這與Objeda等［12］研究結果一致。長白豬和大白豬均有較高的A等位基因頻率，分別為0．742和0．826。

表3 各品種IGF2基因的基因型頻率和基因頻率Tab．3 The genotype and allele frequency of IGF2 in the tested breed

2．3 RYR1基因的基因頻率和基因型頻率

各品種RYR1 c．1843 C＞T基因型頻率及基因頻率的分布見表4。結果表明:各品種群體均有極高的有利基因型頻率，僅有1家豬場有1頭nn基因型氟烷應激個體;每個豬場杜洛克、長白、大白群體有少量的Nn基因型雜合子，以杜洛克群體Nn基因型個體比例為高，達10．2%。

表4 各品種RYR1基因的基因型頻率和基因頻率Tab．4 The genotype and allele frequency of RYR1 in the tested breed

2．4 不同品種RYR1、IGF2與MUC13的基因型組合分布

杜洛克、長白、大白豬群RYR1、IGF2與 MUC13基因型組合分布見圖 5，6，7。

結果表明:在所檢測的群體

中，杜洛克豬群 RYR1、IGF2、MUC13基因均為有利基因型組合NN/AA/GG的個體數為212頭，占群體總量的65．4%(212/324);長白豬群有利基因型組合

NN/AA/GG的個體數為73頭，占群體總量的19．9%(73/367);大白豬群有利基因型組合NN/AA/GG的個體數為143頭，占檢測群體總量的 28．4%(143/503)。

3 討論

3．1 關于MUC13基因的選育

斷奶前仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產中的常見疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。據保守估計，我國每年至少有1 000萬頭斷奶前仔豬腹瀉致死病例，由此

圖1 杜洛克豬群RYR1、IGF2與MUC13的基因型組合分布圖Fig．1 Distribution of RYR1，IGF2，MUC13 genotype combinations in duroc pigs

圖2 長白豬群RYR1、IGF2與MUC13的基因型組合分布圖Fig．2 Distribution of RYR1，IGF2，MUC13 genotype combinations in landrace pigs

造成巨額經濟損失。而產腸毒素大腸桿菌(ETEC)F4ac是引發(fā)斷奶前仔豬腹瀉的最主要致病菌。江西農業(yè)大學動物生物技術國家重點實驗室培育基地自2002年以來，通過全基因組連鎖定位分析、目的區(qū)域的斷點重組分析和遠緣群體的高通量SNPs標記關聯性分析等嚴謹的遺傳研究手段，確定了MUC13為決定斷奶前仔豬腹瀉易感性的ETEC F4ac受體基因。通過來自292頭純種及1 315雜種個體的屠宰測定驗證，發(fā)現了對ETEC F4ac易感和抗性個體鑒別準確率大于97%的關鍵突變位點，由此建立了高精準度的、具有完全自主知識產權的斷奶前仔豬腹瀉抗病育種新技術。

本研究對MUC13的關鍵變異位點進行了檢測，結果顯示，杜洛克群體有利(抗性)等位基因頻率很高，這與生產上杜洛克種豬腹瀉比例總體較低現狀吻合，杜洛克豬群只需進行少量個體的淘汰，其中AA基因型公母豬、AG基因型公豬一次性淘汰，AG基因型母豬根據生產性能盡量減少選留，經過2～3個世代選育即可育成抗斷奶前ETEC F4ac腹瀉純系。長白、大白豬群不利等位基因頻率較高，表明需要經過多世代選育，在兼顧表型選擇和性能測定的前提下，逐世代加大GG純合抗性個體的選留比例，逐步淘汰AA和GA易感型個體，使育種群中有利基因頻率加大，以增加種群對仔豬腹瀉的抗性。

現場選種實踐中，為了提高新生仔豬腹瀉抗性，建議采用兩階段選育的育種策略。在仔豬出生時采集耳樣進行MUC13基因檢測，根據基因型選擇合適數量的群體進行性能測定，性能測定結束后，利用個體性能測定數據結合系譜信息，根據EBV指數的高低排序，由高至底進行選種。具體選配時優(yōu)先選擇抗性公豬配種;需要使用易感公豬時，盡量使用雜合子個體;盡量避免抗性母豬與易感公豬配種。然而，仔豬腹瀉受多種因素影響(細菌/病毒/寄生蟲/營養(yǎng)/飼養(yǎng)管理)，在開展基因育種的同時，仍需兼顧免疫、飼料和環(huán)境控制等方面，以進一步降低仔豬(特別是斷奶仔豬)腹瀉的發(fā)病率。

圖3 大白豬群RYR1、IGF2與MUC13的基因型組合分布圖Fig．3 Distribution of RYR1，IGF2，MUC13 genotype combinations in large white pigs

3．2 關于IGF2基因的選育

杜洛克、長白、大白是目前我國養(yǎng)豬生產中的主流商業(yè)豬種，均為高度選育品種，特別在產肉性能方面經歷了強選擇壓力。本研究揭示IGF2增加產肉量的有利基因頻率在這些品種中的頻率較高，符合品種的選育歷史現狀。在選育過程中，對于專門化父系，建議淘汰GG型個體，GA個體若是母豬可以保留;若是公豬，在條件許可的情況下予以淘汰。通過2～3個世代的選育，有望將有利等位基因A在種群中固定。在純繁或雜交生產商品豬時，盡量選擇AA型公豬個體，以提高后代的生長性能。

Stinckens等［13］在大規(guī)模生產母豬群體(包括555頭來自合成系母豬以及111 330頭純種長白母豬)中開展了IGF2基因g．3073 G＞A的檢測及其與母豬繁殖性狀的相關性分析，結果表明來自父本的有利于肌肉生長和瘦肉率的AA等位基因型與母豬的產仔數及使役年限呈顯著負相關，并推測這種負面效應可能是由于瘦肉率的增加和低脂肪沉積所致。該研究揭示了IGF2基因QTN(g．3073 G＞A)效應對于種母豬具有兩面性:一方面能夠增加胴體瘦肉率與降低背膘厚，另一方面會造成母豬的產仔數及使役年限的下降。基于此，針對IGF2基因的專門化品系選育最佳模式為:父系應該持續(xù)選留能夠增加瘦肉率的AA基因型個體，而母系應該選擇能夠提高母豬繁殖力的GG型個體。由于IGF2基因為父本印跡基因［14－15］，來自于母本的G等位基因在后代中被沉默，因而不會影響商品代個體的瘦肉率。采用這種模式進行配套系選育時，最終的商品豬既可提高生長速度，又可兼顧產仔數。本研究中的IGF2 g．3073 G＞A的檢測結果將有利于受試種群的分化定向選育改良。

3．3 關于RYR1基因的檢測

在本研究中，各受試群體的氟烷敏感抗性基因頻率很高，但一部分群體仍存在一定頻率的敏感基因攜帶者，特別是部分杜洛克群體，這與采樣調研時所了解到的種豬曾引進過臺系杜洛克或摻有皮特蘭血緣的杜洛克品系有關。根據本檢測結果，各采樣場杜洛克、長白、大白種群盡量選留NN基因型進行純種繁育，可建立氟烷敏感應激陰性豬群。

3．4 關于多基因聚合育種

RYR1、IGF2與MUC13的NN/AA/GG有利等位基因型組合個體比例在各豬場、各品種差異較大，以杜洛克群的65．4%為最高，大部分小于20%，由此可見，在兼顧表型和性能測定的情況下，需經過多世代選育才能達到將此三個主效位點有利等位基因選育純合的目的，杜洛克選育較之大白、長白更易于育成純合品系。

致謝:感謝廈門國壽種豬開發(fā)有限公司、福建永誠畜牧有限公司、福建光華百斯特生態(tài)農牧發(fā)展有限公司、龍巖市龍馬畜牧飼料有限公司種豬場、龍巖市萬龍原種豬發(fā)展有限公司、龍巖市晨興養(yǎng)殖有限公司等積極協(xié)助本實驗樣品采集;感謝江西農業(yè)大學任軍博士對基因檢測實驗的指導和論文的修改。

［1］Andersson L，Georges M．Domestic-animal genomics:deciphering the genetics of complex traits［J］．Nature Review Genetics，2004，5:202 －212．

［2］Evans G J．Identification of quantitative trait loci for production traits in commercial pig populations［J］．Genetics，2003，164:621－627．

［3］Andersson L．Genetic dissection of phenotypic diversity in farm animals［J］．Nat Rev Genet，2001(2):130 － 138．

［4］Ren J，Tang H，Yan X M，et al．A pig-human comparative RH map comprising 20 genes on pig chromosome 13q41 that harbours the ETEC F4ac receptor locus［J］．Journal of Animal Breeding and Genetics，2009，126:30 －36．

［5］Van Laere A，Nguyen M，Braunschweig M，et al．A regulatory mutation in IGF2 causes a major QTL effect on muscle growth in the pig［J］．Nature，2003，425:832 －836．

［6］Jeon J T．A paternally expressed QTL affecting skeletal and cardiac muscle mass in pigs maps to the IGF2 locus［J］．Nature Genet，1999，21:157 －158．

［7］Yang G C，Ren J，Guo Y M，et al．Genetic evidence for the origin of an IGF2 quantitative trait nucleotide in Chinese pigs［J］．Animal Genetics，2006，37:179 －180．

［8］Florini J R，Ewton D Z，McWade F J．IGFs，muscle growth，and myogenesis［J］．Diabetes Rev，1995(3):73 －92．

［9］Amarger V．Comparative sequence analysis of the Insulin － IGF2 － H19 gene cluster in pigs［J］．Mamm Genome，2002，13:388－398．

［10］Fujii J．Detection of the HAL gene in swine:a point mutation in the skeletal muscle rynodine receptor gene(RYR1)［J］．Animal Genetics，1993，21:56 －61．

［11］丁能水，周利華，黃路生，等．氟烷基因對豬繁殖性能影響的研究［J］．江西農業(yè)大學學報，1999，21(4):552－554．

［12］Ojeda A，Huang L S，Ren J，et al．Selection in the making:A worldwide survey of haplotypic diversity around a causative mutation in porcine IGF2［J］．Genetics，2008，178:1639 －1652．

［13］Stinckens A，Mathur P，Janssens S，et al:Indirect effect of IGF2 intron3 g．3072G ＞ A mutation on prolificacy in sows［J］．Anim Genet，2010，41:493 －498．

［14］Constancia，M．Deletion of a silencer element in Igf2 results in loss of imprinting independent of H19［J］．Nature Genet，2000，26:203 －206．

［15］De Koning D J．Genome-wide scan for body composition in pigs reveals important role of imprinting［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2000，97:7947 －7950．