酶法輔助提取迷迭香中三萜酸的工藝研究

李開泉，陶華蕾

(1．江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000;2．宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春336000)

迷迭香(Rosmarinus officinalis L．)為唇形科多年生宿根草本、大型叢生常綠灌木植物，具有強(qiáng)烈芳香氣味。迷迭香原產(chǎn)南歐各國，我國亦有栽培，且資源豐富。迷迭香性溫、味辛、無毒、具有健胃、發(fā)汗、安神等功效［1］?，F(xiàn)代研究表明，迷迭香具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、保肝、治療心血管等作用［2－4］。迷迭香油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等有中等強(qiáng)度抗菌作用。迷迭香制劑有健胃、發(fā)汗、安神、亢進(jìn)消化機(jī)能，治療各種頭痛［5］。研究表明，迷迭香中主要活性成分為三萜酸，而三萜酸是植物界分布較廣、毒副作用較小的天然藥物，能通過細(xì)胞毒作用、增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤血管形成等多種機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤活性，對人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT－29、白血病細(xì)胞系HL－60、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、表皮樣癌細(xì)胞系A(chǔ)431等多種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用［6－7］。因而三萜酸已成為國內(nèi)外普遍關(guān)注、研究活躍的天然藥物。三萜酸的主要來源為植物，但由于在植物體內(nèi)含量較低，加上其同分異構(gòu)體齊墩果酸的存在，給提取分離帶來很大困難。提取迷迭香中的三萜酸一般采用冷浸法、超聲法、乙醇回流法等，這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。冷浸法無需加熱，有效成分不易破壞，但存在提取時間長、溶劑用量大、操作費(fèi)時等缺點(diǎn)。超聲法提取具有快速、完全、溶劑用量小、有效成分得率高、無需加熱、能避免高溫對有效成分的破壞等優(yōu)點(diǎn)，但目前超聲技術(shù)僅在實(shí)驗(yàn)室使用，規(guī)?；a(chǎn)尚需時日。而酶法已廣泛用于植物有效成分的輔助提取中。如纖維素酶法提取黃酮、多糖、色素、生物堿等，具有操作簡單、高效穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)［8－10］。為了促進(jìn)國產(chǎn)迷迭香資源的開發(fā)利用，為三萜酸的規(guī)模化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，以迷迭香為原料對酶法輔助提取三萜酸的工藝進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1．1 材料試劑

迷迭香葉原料購自北京遠(yuǎn)馨芬芳科技有限公司(產(chǎn)地新疆)，經(jīng)江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為唇形科植物迷迭香(Rosmarinus officinalis L．)。纖維素酶(40 000 U/g，棗莊市杰諾生物酶有限公司產(chǎn));體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇(食用級廣西糖廠);NaOH、HCl均為分析純;蒸餾水。

1．2 儀器設(shè)備

FW－100高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);FC－204分析天平(上海天平分析器廠);TG16－WS高速離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司);RE－3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);202－26A型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)。

1．3 提取工藝

迷迭香葉→烘干→粉碎→過60目篩→加溫水潤濕→加酶劑水解→高溫滅酶→抽濾→乙醇浸提→提取液→回收溶劑→浸膏→烘干→稱量→計(jì)算得率。浸膏得率按下式計(jì)算:

浸膏得率=提取所得沉降物質(zhì)量/迷迭香葉干粉質(zhì)量×100% (1)

1．4 單因素試驗(yàn)

影響酶解效果的主要因素有:酶劑用量、酶解時間、酶解溫度和體系pH值。采用加酶量(3，4，5，6，7 mg/g)、酶解時間 (1．5，2，2．5，3，3．5 h)、酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)、體系 pH 值(4．5，5，5．5，6，6．5)各5個水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得出最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素試驗(yàn)

2．1．1 酶劑用量的影響 在固定酶解時間、酶解溫度和酶解pH值等因素不變的情況下，按酶劑用量進(jìn)行試驗(yàn)，不同酶量對迷迭香三萜酸提取率的影響見圖1。酶用量是影響酶促反應(yīng)的重要因素，當(dāng)用量較小時，由于固定了酶解時間，故酶解不完全。當(dāng)酶用量為3～5 mg/g時，三萜酸提取率迅速上升，至用量6．0 mg/g時提取率最大，繼續(xù)增加酶量提取率反而下降。

2．1．2 酶解時間的影響 在固定酶劑用量、酶解溫度和酶解pH值等因素不變的情況下，按酶解時間進(jìn)行試驗(yàn)，不同酶解時間對迷迭香三萜酸提取率的影響見圖2。酶解時間影響酶解效率，反應(yīng)時間過短破壁效果差，酶解不充分;時間過長，有效成分的結(jié)構(gòu)可能受到破壞。隨著提取時間的延長，三萜酸提取率呈上升趨勢，當(dāng)達(dá)到3．0 h后提取率增長趨緩。

2．1．3 酶解溫度的影響 在固定酶劑用量、酶解時間和酶解pH值等因素不變的情況下，按酶解溫度進(jìn)行試驗(yàn)，不同酶解溫度對迷迭香三萜酸提取率的影響見圖3。溫度對酶活性的發(fā)揮具有較大影響，三萜酸得率隨著酶解溫度的增加而增加，當(dāng)酶解溫度達(dá)到55℃時得率最高。

圖1 酶劑用量對三萜酸提取率的影響Fig．1 Affect of amount of enzyme on triterpene extraction rate

圖2 酶解時間對三萜酸提取率的影響Fig．2 Affect of Hydrolysis time on triterpene extraction rate

圖3 酶解溫度對三萜酸提取率的影響Fig．3 Affect of Reaction temperature on triterpene extraction rate

圖4 酸堿度對三萜酸提取率的影響Fig．4 Affect of pH value on triterpene extraction rate

2．1．4 酶解pH值的影響 在固定酶劑用量、酶解時間和酶解溫度等因素不變的情況下，按pH值進(jìn)行試驗(yàn)，不同酶解pH值對迷迭香三萜酸提取率的影響見圖4。體系的pH值對三萜酸得率有一定影響，在體系pH值6．0左右時，三萜酸得率基本穩(wěn)定，當(dāng)體系pH值過小或過大時三萜酸得率均有所下降。

單因素研究結(jié)果為:加酶量6 mg/g、酶解時間3．0 h、酶解溫度55℃、體系pH值6．5。

2．2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

采用L9(34)正交表，以酶劑用量、酶解時間、酶解溫度和酶解pH值為研究對象，各取3水平。每用迷迭香葉干粉50 g，以提取物干質(zhì)量為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平設(shè)計(jì)Tab．1 Factors and levels

結(jié)果表明，酶劑用量、酶解pH值對提取率影響具有顯著性差異，因素A取A1為好，D取D3為好，B與C不顯著，其水平可任取。確定其最佳工藝為A1B3C1D3，即酶劑用量6．5 mg/g、酶解時間2．5 h、酶解溫度45℃、酶解pH值為6．5。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Results of L9(34)orthogonal experimen test

表3 方差分析Tab．3 Variance analysis

2．3 工藝驗(yàn)證

取迷迭香葉干粉各800 g，共3份，照優(yōu)選出的工藝條件進(jìn)行提取。結(jié)果浸膏干重在4．03～4．63 g，均值為4．58 g，RSD=1．88%(n=3)。表明酶法輔助提取迷迭香中三萜酸的工藝條件是穩(wěn)定的。

3 結(jié)論

(1)本研究首次采用纖維素酶法，通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)對迷迭香三萜酸的提取工藝進(jìn)行了初步探討，優(yōu)化了酶法輔助提取迷迭香三萜酸的提取條件，其適宜提取參數(shù)為:酶劑用量6．5 mg/g，酶解溫度45℃，酶解時間2．5 h，酶解pH值為6．5。在上述提取條件下迷迭香浸膏的干質(zhì)量為4．58 g。

(2)正交實(shí)驗(yàn)的極差結(jié)果表明，4個因素對迷迭香三萜酸得率的影響順序?yàn)?酶解pH值＞酶劑用量＞酶解溫度＞酶解時間。

(3)纖維素酶能有效地破壞細(xì)胞壁，加速了有效物質(zhì)的釋放。纖維素酶價格低廉，酶解條件溫和，工藝簡單，生產(chǎn)安全性好，值得推廣應(yīng)用。本結(jié)果為迷迭香三萜酸工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。

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