木質素相關合成酶在甘藍型黃、黑籽油菜中的表達差異

冉秀芝，雷 波，梁 穎，李加納，李 波，柴友榮

(1.重慶理工大學化學化工學院，重慶 400054;2.貴州省煙草科學研究所，貴陽 550081;3.重慶市油菜工程研究中心，重慶 400716;4.重慶市公安局，重慶 401147)

木質素是自然界中的第二大聚合物，是由多種簡單的苯丙烷及其衍生物經聚合形成的復雜的聚合物［1］。在木質素生物合成中有許多酶參與，其中:對 － 香豆酸連接酶(E.C.6.2.1.12，p－coumarate－CoA ligase，4CL)是苯丙烷代謝總途徑的最后一個酶，可為大量天然化合物的合成提供前體物質(包括木質素);5－羥基阿魏酸羥化酶(EC None，ferulate 5－h(huán)ydroxylase，F5H)是一種 P450 依賴的單加氧酶，是S－木質素合成中的必須環(huán)節(jié);松柏醇脫氫酶 (E.C.1.1.1.195，cinnamyl－alcohol dehydrogenase dehydrogenase，CAD)是合成木質醇的最后一步反應的酶，其功能是將CCR的還原產物再還原為相應的松柏醇，為木質素的聚合提供相應的、直接的前體物質。

有關木質素生物合成的酶學研究表明，在木質素的生物合成途徑中，4CL、F5H、CAD都是關鍵酶之一［2－3］。前期有關木質素甘藍型黃、黑籽油菜種皮木質素及相關酶的比較研究表明，在甘藍型黃、黑籽油菜的種皮中都可能存在木質素生物合成的苯丙烷代謝途徑，4CL、CAD和F5H均參與了該代謝途徑［4］。為了深入分析甘藍型黃籽油菜種皮中木質素含量差異形成的分子生物學機制，本研究以1對甘藍型黃、黑籽油菜的近等基因系為材料，研究了木質素生物合成部分關鍵酶4CL、F5H和CAD在黃、黑籽油菜的不同組織中的表達差異，為油菜的分子育種和優(yōu)質育種提供重要的理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與流程

1)植物材料:1對甘藍型黃、黑籽油菜近等基因系(黃籽:L2，黑籽:L1)，來源于甘藍型黑籽油菜×芥菜型黃籽油菜的后代。

2)實驗技術路線:取供試材料的花、蕾和不同發(fā)育時間的種子為材料，先抽提RNA，再經反轉錄得到cDNA，進行表達差異的研究，其流程如圖1所示。

圖1 甘藍型黃、黑籽油菜種皮的木質生物合成酶表達研究流程

1.2 cDNA的獲得

1)RNA的抽提。使用上海華舜生物工程有限公司的小量植物 (葉)總 RNA抽提試劑盒(W6771)。苯酚/氯仿標準裂解步驟:① 液氮冷凍條件下將植物葉搗碎成粉末，待液氮自然揮發(fā)后，加入1 mL RD液，立即用移液器抽打5次以懸浮樣品，將勻漿液移入1.5 mL離心管中，蓋上蓋子，高速振蕩2 min;② 室溫靜置 5 min后，加入200 μL氯仿，用力顛倒離心管混勻，室溫靜置使之分層，15 000 r/min離心5 min，小心地移取水相至1.5 mL離心管中;③加入一半體積的75% 乙醇，徹底混勻后，全部移入吸附柱，離心30 s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一個收集管中;④加入500 μL RP液，離心30 s，將吸附柱移入另外一個干凈的收集管中;⑤ 加入 500 μL W3液，靜置1 min后，離心15 s，棄收集管中的液體，將吸附柱移入同一個收集管中;⑥ 加入 500 μL W3液，離心15 s;⑦倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一個收集管中，離心1 min;⑧ 將吸附柱放入另外一個干凈的1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入50 μL純水，室溫靜置1 min后，離心 1 min，將1.5 mL離心管(RNA)貯存于－70℃待用。

2)去除RNA中的基因組DNA。①在微量離心管中配制下列反應液(含量50 mL):總RNA 20 ～50 μg，10 × DNaseⅠ Buffer 5 μL，DNaseⅠ(RNase－free，5 U/μL)2 μL，RNase Inhaibitor(40 U/μL)0.5 μL，用 DEPC H2O 補加至 50 mL;②37℃反應 20 ～30 min，加入 50 μL DEPC H2O;③加入 100 μL(等量)苯酚/氯仿/異戊醇(5∶24∶1)，充分混勻;④ 離心，取上層(水層)移至另一微量離心管中，加入100 μL(等量)苯酚/氯仿/異戊醇(5∶24∶1)，充分混勻;⑤ 離心，取上層(水層)移至另一微量離心管中，加入10 μL(1/10量)的3M NaOAc(pH值為5.2);⑥ 加入250 μL(2.5倍量)的冷無水乙醇，－20℃放置30～60 min;⑦ 離心，回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥;⑧用適量的DEPC H2O溶解后，進行Agarose檢測電泳以確認是否除去基因組DNA。

3)反轉錄合成cDNA第1鏈(20 μl反應體系)。使用Invitrogen公司的SuperScriptTMII RTPCR 試劑盒(適用于10 pg～5 μg總 RNA)，具體操作步驟:①在滅菌的小離心管中加入以下幾種成分:50 ng/μL 隨機引物 1 μL，總 RNA 5 μg，pH值為7.0的10 mM dNTP混合物1 mL，用無菌的蒸餾水補充至13 mL;② 在65℃溫育5 min，然后冰浴至少1 min;③用另一只滅菌的試管將以下各成分按照順序加入:5×First－strand Buffer 4 mL，0.1M DTT 1mL，RNaseOUTTMRecombinant RNase Inhibitor(Cat.no.10777 － 019，40 U/μL)1 mL，SuperScriptTMⅢ RT(200 U/μL)1 mL(以上是1個樣品的量，如果有多個樣品的話，應該加倍)，然后小心地充分混勻，離心;④ 在各反應管中加入上述混合液，25℃溫育5 min;⑤ 在50℃反應60 min;⑥ 用70℃下15 min后中止反應，然后在冰上冷卻;⑦ 離心收集反應混合物，放置在－20℃ 備用。

1.3 引物的設計

F4CLC5＇－TACATCCCTAACCACCTCCCTCTC－3＇(24nt，Mw=7150.7，Tm=66.28，對應于 At4CL1 gene(AF106084)的185～208bp);

R4CLC5＇－TCTAGCTCAGCTGGAGCCACCTG－3＇(23nt，Mw=7062.6，Tm=68.12，互補于 At4CL1 gene(AF106084)的1509～1487bp)。

2)CAD基因引物。根據AtCAD5和AtCAD4基因的公共保守區(qū)設計十字花科CAD基因家族總體表達檢測引物(引物不跨內含子)，其序列如下:

FCAD545＇－GTGGGATCAGATGTGAGCAAGTTC－3＇(24nt，Mw=7534.9，Tm=64.57，對應于 At－CAD5 mRNA(AY302082)的232～255bp);

RCAD545＇－ACCGCCATTCCTTCTGGAATCTT－3＇(23nt，Mw=6987.6，Tm=62.77，互補于 AtCAD5 mRNA(AY302082)的464～442bp)。

3)十字花科F5H基因引物。根據已報道的甘藍型油菜F5H基因家族3個成員cDNA的保守區(qū)設計甘藍型油菜F5H基因家族總體表達檢測引物(引物不跨內含子)，其序列如下:

FBNF5HC5＇－GACTTATGACCGAGCCGACATG－3＇(22nt，Mw=6806.5，Tm=64.54，對 應 于BNF5H1 mRNA(AF214007)的386～407bp);

(2)錨索、錨桿設計巖土工程參數參考值。根據《建筑邊坡工程技術規(guī)范》(GB 50330—2002)推薦值并結合實際綜合考慮，推薦砂漿與螺紋鋼筋的粘結強度為2 000 kPa，砂漿與鋼絞線的粘結強度為2 500 kPa，砂漿與片麻巖的粘結強度為1 000 kPa。

RBNF5HC5＇－CTTGGGAACGAAGTAACCGTCG－3＇(22nt，Mw=6846.5，Tm=64.54，互補于BNF5H1 mRNA(AF214007)的1250～1229bp)。

以上引物的合成均由上海生工完成。

1.4 PCR反應體系及條件

1)PCR擴增體系。采用50 μL的擴增體系，按照實驗的需要加入對應的模板，且每個基因采用相應的引物和反應參數，PCR反應體系如表1所示。

表1 PCR反應體系

2)各個基因的PCR反應參數。① 4CL的PCR反應參數:94℃，2 min→(94℃，1 min→53℃，30 s→72℃，1 min)×30 →72℃，10 min →16℃，holding;即94℃預變性2 min，隨后以94℃變性1 min、53℃退火30 s、72℃延伸1 min的條件進行30個循環(huán)的擴增，最后在72℃保溫10 min，以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。②CAD的PCR反應參數:94℃，2 min→(94℃，1 min →53℃，30 s →72℃，30 s)×30 →72℃，10 min →16℃，holding;即94℃預變性2 min，隨后以94℃變性1 min、53℃退火30 s、72℃延伸30 s的條件進行30個循環(huán)的擴增，最后在72℃保溫10min，以2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。③ F5H的 PCR反應參數:94℃，2 min→(94℃，1 min →61℃，1 min →72℃，1.5 min)×30 →72℃，10 min →16℃，holding;即94℃預變性2 min，隨后以94℃變性1 min、61℃退火1 min、72℃延伸1.5 min的條件進行30個循環(huán)的擴增，最后在72℃保溫10 min，以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與討論

2.1 4CL的表達差異

以cDNA為模版擴增的4CL的片段長度約為1 200 bp，與預期長度一致，4CL在甘藍型油菜中的表達如圖2所示。

圖2 4CL在甘藍型油菜中的表達

如圖2所示，在甘藍型黃籽油菜中，4CL在蕾期和10 d種中的表達最強，在花和20 d種的表達次之，而在30 d種中的表達最弱;在甘藍型黑籽油菜中，4CL在10 d和30 d的種子中的表達最強，在蕾、花和中種的表達較弱，幾乎為前兩者的1/2。4CL在甘藍型黃、黑籽油菜的上述各器官中的表達差異來看，在花和中種的表達差異不明顯;在蕾、幼種和老種中的表達具有明顯的差異，即在蕾期，黑籽中4CL的表達比黃籽弱，而在幼種和老種時期，黑籽中4CL的表達比黃籽強。另外，在種子的發(fā)育進程中:4CL的表達在甘藍型黃籽油菜中逐漸降低，且在老種時期的表達迅速下降;4CL在甘藍型黑籽油菜種子中的表達量卻先減少后增加。因此，在種子的發(fā)育進程中，在甘藍型黃、黑籽油菜之間4CL的轉錄水平差異明顯。

在模式植物——擬南芥的4CL的3個基因家族成員中:At4CL1和At4CL2屬于Ⅰ類，主要參與木質素和其他酚類化合物的合成;At4CL3屬于Ⅱ類，主要參與黃酮類化合物的合成。同時，在擬南芥中3種同工酶基因在植物的不同器官的表達都有差異［5］。在本研究中，4CL在甘藍型黃、黑籽油菜中的不同器官或組織中的表達存在差異，與前人的研究結果一致。同時，本研究還發(fā)現在不同種皮顏色的甘藍型油菜品系間，4CL在同一器官中的表達也存在差異。

Jürgen 等［6］研 究 了 擬 南 芥 的 At4CL1 和At4CL2兩種同工酶對底物的親和性，結果發(fā)現:2種酶均能催化肉桂酸發(fā)生反應，但只有4CL1才能催化阿魏酸發(fā)生反應;而4CL2的主要功能是在4CL1反應的下游起清除阿魏酸的作用。

前期有關木質素含量與4CL活性關系的研究表明:在種子的發(fā)育進程中，其活力在甘藍型黃、黑籽油菜中呈極顯著差異;同時，木質素含量在甘藍型黃、黑籽油菜中與4CL活力的相關性分別達到極顯著水平和顯著水平［4］。本研究的結果表明:在種子的發(fā)育進程中，4CL在甘藍型黃、黑籽油菜之間在轉錄水平上存在差異，特別是在30d的種子中，黑籽油菜中的4CL表達比在黃籽油菜中強許多倍(圖2)。因此，4CL參與了油菜的種皮形成過程中木質素的生物合成，且轉錄水平的不同可能引起木質素含量在黃、黑籽油菜之間的差異。

2.2 F5H的表達差異

F5H在甘藍型黃、黑籽油菜中的表達實驗結果如圖3所示。以cDNA為模版擴增的F5H的片段長度約為800 bp，與預期長度一致。在甘藍型黃、黑籽油菜之間，F5H在花、蕾和10 d和20 d的種子在轉錄水平上差異不明顯，而在30 d種中的差異卻十分明顯，黑籽中的表達量是黃籽中的5倍以上。同時，F5H在種子中的表達明顯低于在花期和蕾期。在種子的發(fā)育進程中，F5H的表達在甘藍型黑籽油菜中逐漸增強，而在甘藍型黃籽油菜中的表達先增強后減弱，這樣，使得F5H在黑籽油菜和黃籽油菜的30 d種中的表達量的差異十分明顯。因此，在種子的發(fā)育進程中，在甘藍型黃、黑油菜之間，F5H的轉錄水平差異明顯(圖3)。

圖3 F5H在甘藍型油菜中的表達

Ramesh Nair等［7］(2000)從加拿大的栽培的甘藍型油菜中分離到3個 F5H的基因，即BNF5H1、BNF5H2和BNF5H3，而從白菜型油菜和甘藍栽培品種的二倍體(這2種二倍體融合后得到多倍體甘藍型油菜)中分別分離得到了BNF5H1和BNF5H2，同時都分離到了BNF5H3。這3個基因的編碼區(qū)有90%的一致性，其中BNF5H1與BNF5H2的一致性更高。其研究結果表明:F5H在甘藍型油菜的莖中表達量最多，而在其種子中的表達量最少，3個基因在葉、根、蕾、花、莢果等其他組織或器官中表達量的差異很微小。

前期有關木質素含量與F5H活性關系的研究結果表明，在種子的發(fā)育進程中，F5H活力在甘藍型黑籽油菜中的活力極顯著高于甘藍型黃籽油菜;同時，木質素含量在甘藍型黃、黑籽油菜中與F5H活力的相關性均達到極顯著水平［4］。本研究結果表明:F5H在甘藍型油菜的花、蕾中的表達比種子中的表達強，這與前人的研究結果一致［7］;F5H在甘藍型黃、黑籽油菜種子中的表達量的不同，可能造成甘藍型黃、黑籽油菜種子中芥子酸含量的不同，從而導致其轉化的芥子酰膽堿的含量也不同，進而可能引起S－木質素含量的不同，導致G/S比率下降。根據前人的研究和本試驗的研究，可以推斷F5H在合成S－木質素的途徑中是必不可少的一種酶，因而要改變木質素的G/S比率，可以對F5H采取分子生物學的操作，培育生產上需要的甘藍型油菜的新品種。

2.3 CAD的表達差異

CAD在甘藍型黃、黑籽油菜的花、蕾和不同成熟度的種子中的表達研究結果表明:以cDNA為模版擴增的CAD片段長度約為250 bp，與預期長度一致，如圖4所示。

圖4 CAD在甘藍型油菜中的表達

在黃、黑籽油菜之間，CAD的表達在花和蕾期的差異不明顯。而在不同種子的發(fā)育時期，CAD的表達差異明顯。在10 d、20 d和30 d種中，黑籽中的表達量分別是黃籽的1.3倍、1.6倍和2.0倍以上;同時，在蕾、花期中的表達比種子的不同時期的強。在種子的發(fā)育進程中，CAD在甘藍型黃、黑籽油菜中的表達都是逐漸減弱，但在黑籽油菜中，這種減弱的趨勢比黃籽油菜要慢些，所以，在30 d種中，CAD在黃籽油菜中比在黑籽油菜中的表達弱得多(圖4)。因此，在種子的發(fā)育進程中，在轉錄水平上，CAD在甘藍型黃、黑油菜之間也存在差異。

在模式植物擬南芥中，CAD被推定有9條CAD基因，分屬于3類，其中:Ⅰ類的CAD6的突變會引起木質素含量和結構的改變;Ⅱ類的CAD3、CAD4和CAD5是白楊SAD最近的同系物，優(yōu)先催化芥子醇和芥子醛，從而參與S－木質醇合成支路［8－10］。

前期有關木質素含量與CAD活性關系的研究結果表明:在種子的發(fā)育進程中，CAD活力在甘藍型黑籽油菜中的活力極顯著高于甘藍型黃籽油菜;同時，木質素含量在甘藍型黃、黑籽油菜中與CAD活力的相關性均達到極顯著水平［4］。CAD表達差異的研究結果顯示，在甘藍型黃、黑籽油菜中，其表達量隨油菜種子的成熟都逐漸減少，在黃籽油菜中，下降的幅度較黑籽油菜的大，因而在30 d種中的表達量具有顯著的差異。因此，在種子的發(fā)育進程中，CAD在甘藍型黃、黑籽油菜之間的轉錄水平上也存在差異，特別是在30 d種中，黑籽油菜中的CAD表達比在黃籽油菜中強許多倍(圖4)。

3 結論與展望

自從梁艷麗等［11］報道在油菜種子發(fā)育過程中木質素是導致黃籽皮殼率低于黑籽的原因之一后，有關木質素導致種皮皮殼率低的原因鮮見報道。梁穎等［12］在研究甘藍型油菜種皮顏色形成相關酶與蛋白質相關性時，推測PAL、PPO和POD可能調控木質素的合成，從而影響種皮厚度的形成。在前期L1和L2這對甘藍型黃黑籽油菜種皮發(fā)育過程中木質素的含量與4CL、F5H和CAD三種酶活力之間呈顯著或極顯著關系［4］。本實驗進一步研究了在轉錄水平上這3種酶在L1和L2之間的差異。實驗結果表明:4CL在甘藍型黃、黑籽油菜中的不同器官或組織中的表達存在差異，在相同的器官中，不同種皮顏色的甘藍型油菜品種的4CL表達也存在差異;F5H在甘藍型黃、黑籽油菜的花、蕾、10 d種、20 d種中的表達差異不明顯，而在30 d種中的表達差異明顯，在同一油菜品系的種子中的表達量明顯低于花和蕾;CAD在甘藍型黃、黑籽油菜的花、蕾中的表達差異不明顯，而在種子的不同發(fā)育時期中表達差異明顯，在相同的油菜品系中，在蕾和花期的表達比在種子的不同發(fā)育期強。4CL主要以阿魏酸和肉桂酸為其催化底物參與木質素的生物合成，而F5H對阿魏酸或松柏醛具有不同的親和性，很有可能引起G－或S－木質素含量的不同，此外，CAD/SAD以松柏醛或芥子醛為底物參與G－或S－木質素的生物合成，因此，這幾種酶在甘藍型黃、黑籽油菜種子中的表達存在差異，特別是在甘藍型黃籽油菜的30 d種中的表達都明顯低于相應的黑籽油菜，說明它們很有可能是導致木質素含量和成分在甘藍型黃、黑籽油菜之間存在差異的主要原因之一。

作為自然界中的第二大聚合物，木質素是植物細胞壁的重要組成成分之一，不僅對農業(yè)、工業(yè)、環(huán)境有著重要的影響，與人們的生活也息息相關，對植物體本身而言，也有重要的功能。在木質素的生物合成過程中有很多酶參與作用，不同酶系之間有可能存在相互作用，其個體和種群間的遺傳變異和環(huán)境因素等都對木質素的含量有不同程度的影響［13］。因此，結合細胞生物學、生物化學、分子生物學等多學科的研究手段，從不同角度來研究不同遺傳背景的油菜在不同組織、器官的木質素的生物合成，不僅對闡明油菜種皮特性形成的生理生化機理及木質素的生物合成機理具有重要的理論價值，并且還可以結合常規(guī)育種手段，通過對木質素生物合成中的酶基因進行操作，在不同組織或器官抑制或過量表達某1個或幾個酶基因，可能培育出品質好而又具有多種抗性的油菜新品種。此外，利用分子生物學的方法來抑制或提高木質素合成酶基因的表達量，在減少造紙用材工藝的消耗，改善牧草品質，或是通過提高木質素含量來增強農作物、樹木的機械強度等方面都具有重要的理論和實踐意義。

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