氯胺酮對乳鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡及NMDAR-2B表達(dá)的影響

石永勇，賈 彬，招偉賢，李向宇，古妙寧

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院，廣州 510515;2廣東省中醫(yī)院)

研究表明，發(fā)育中的大腦對氯胺酮非常敏感，持續(xù)暴露5 h即足以引起顯著的神經(jīng)元凋亡［1］。氯胺酮 為 N-甲 基-D-天 冬 氨 酸 (N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體拮抗劑，其引起發(fā)育中神經(jīng)元凋亡的確切機(jī)制尚不清楚。2011年6月～2012年1月，我們觀察了氯胺酮對新生乳鼠海馬CA3區(qū)NMDA受體表達(dá)的影響，探討氯胺酮引起神經(jīng)元凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 氯胺酮(批號:100407，福建古田藥業(yè)有限公司)，NMDAR-2B抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，凋亡試劑盒購自美國寶靈曼公司(批號:12469500)，MSHOT數(shù)碼成像系統(tǒng)(廣州市明美光電技術(shù)有限公司)，Olympus BX50顯微鏡(Olympus);12只新生7 d的SD大鼠，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及標(biāo)本制作 12只SD大鼠用苦味酸標(biāo)記后稱體質(zhì)量，隨機(jī)分為氯胺酮組和對照組各6只。氯胺酮組腹腔注射氯胺酮20mg/kg，間隔90 min再次注射，共計(jì)5次;對照組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積的生理鹽水。處理間隙將新生大鼠放回籠中，呼吸空氣。第一次注射24 h后，腹腔注射10%水合氯醛深麻醉后，以冰鹽水經(jīng)心臟灌注，灌注至清水流出后以4%多聚甲醛灌注固定。斷頭取腦，修塊后固定于4%多聚甲醛中24 h以上。常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作4 μm厚切片。

1.2.2 觀察項(xiàng)目 ①凋亡細(xì)胞密度:采用TUNNEL法。切片常規(guī)脫蠟至水，劃圈，入蒸餾水;切片放入0.1%TritonX100液室溫下8 min:流水沖洗2 min，入PBS洗1 min，3次;滴加標(biāo)記混合物37度標(biāo)記60 min;入PBS洗1 min，3次;滴加轉(zhuǎn)換液37℃處理30 min;入PBS洗1 min，3次;BCIP-NBT顯色液顯色10 min，流水沖洗3 min，擦去組織周圍水分，入PBS洗1 min，3次，GVA水溶性封片劑封片，常溫晾干。結(jié)果判定:凋亡小體呈黑色或紫藍(lán)色位于細(xì)胞核內(nèi)。在200倍顯微鏡下計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)，并采用用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)計(jì)算凋亡細(xì)胞密度。凋亡細(xì)胞密度=凋亡細(xì)胞數(shù)/統(tǒng)計(jì)場面積。②海馬神經(jīng)元CA3區(qū)NMDA-2B受體表達(dá):采用免疫組化法。切片經(jīng)純二甲苯脫臘2次，每次6 min;梯度乙醇脫二甲苯各2 min;自來水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min;加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下作用10 min;切片放入已沸騰的檸檬酸修復(fù)液中，繼續(xù)加熱至溶液冒小氣泡但不沸騰為度，保持10 min;停止加熱，冷卻至室溫約15 min，流水沖洗，PBS液洗2次，擦干切片組織周圍表面水分劃圈;加入5%BSA封閉液，室溫下作用20 min;加入NMDA-2B抗體(1∶40)，37℃恒溫箱內(nèi)1 h;PBS沖洗，3 min ×3次，滴加生物素化二抗，37℃恒溫箱內(nèi)20 min;PBS沖洗，3 min×3次，滴加鏈霉菌卵白素-辣根過氧化物酶，37℃恒溫箱內(nèi)20 min;PBS洗后加入DAB，顯色1～5 min;蘇木素淺復(fù)染，常規(guī)脫水、封片，分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬CA3區(qū)元凋亡細(xì)胞密度 光鏡下可見凋亡細(xì)胞體積縮小，凋亡小體呈黑色或紫藍(lán)色位于細(xì)胞核內(nèi)。對照組僅見少量散在的凋亡細(xì)胞(圖1A)，氯胺酮組可見較多染色質(zhì)固縮，呈棕黃色的凋亡細(xì)胞(圖1B)。氯胺酮組和對照組大鼠的凋亡細(xì)胞密度分別為 3.252 ±2.330、1.053 ±0.562(P ＜0.05)。

圖1 氯胺酮麻醉對新生大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響(×200)

2.2 海馬CA3區(qū)NMDA-2B受體表達(dá) NMDA受體陽性細(xì)胞呈散在均勻分布于海馬CA3區(qū)，DAB顯色呈棕黃色。與對照組相比，氯胺酮組陽性細(xì)胞明顯增多(圖2)。圖像分析發(fā)現(xiàn)對照組光密度值為15.38 ±3.72，氯胺酮組為22.25 ±1.64，兩組比較，P=0.0007。

圖2 氯胺酮對海馬CA3區(qū)NMDA受體表達(dá)的影響(×100)

3 討論

氯胺酮是惟一具有鎮(zhèn)痛作用的靜脈麻醉藥，由于其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)，對呼吸、循環(huán)系統(tǒng)影響輕，在小兒麻醉中得到廣泛應(yīng)用［2，3］。但 1999 年 Ikonomidou等［4］在《科學(xué)》雜志報(bào)道了包括MK801和氯胺酮在內(nèi)的NMDA受體拮抗劑可引起發(fā)育神經(jīng)元廣泛凋亡后，引起了臨床對氯胺酮在小兒麻醉中應(yīng)用安全性的擔(dān)憂。

NMDA受體是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸離子型受體，具有許多不同變構(gòu)調(diào)控位點(diǎn)并對Ca2+高度通透。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，NMDA受體主要分布在大腦皮層及海馬，尤其以海馬最為豐富。在中樞神經(jīng)發(fā)育的過程中，NMDA受體通過不同亞型的選擇性表達(dá)而改變自身的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響NMDA受體介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)Ca2+依賴的第二信使系統(tǒng)，最終實(shí)現(xiàn)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程的復(fù)雜調(diào)控。在未成熟大腦中，NMDA受體活性對于神經(jīng)元存活至關(guān)重要。既往研究表明，阻斷這些受體可引起新生動物神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

近年來的研究證實(shí)，年幼動物接受氯胺酮全身麻醉可引起大腦神經(jīng)元凋亡，引起學(xué)習(xí)記憶功能損害［5］。本研究結(jié)果顯示，氯胺酮干預(yù)后大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的凋亡顯著增加;重復(fù)注射氯胺酮可引起新生大鼠海馬NMDA-2B受體表達(dá)明顯增加，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致［6］。據(jù)此我們認(rèn)為，長時(shí)間暴露于氯胺酮環(huán)境中可觸發(fā)發(fā)育中神經(jīng)元凋亡增加，其機(jī)制可能與氯胺酮引起NMDA受體表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

［1］Brambrink AM，Evers AS，Avidan MS，et al.Ketamine-induced neuroapoptosis in the fetal and neonatal rhesus macaque brain［J］.Anesthesiology，2012，116(2):372-384.

［2］劉俊鋒，崔萬紅.咪唑安定、氯胺酮口服在小兒手術(shù)基礎(chǔ)麻醉中的應(yīng)用效果觀察［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(34):103-104.

［3］張國生，武巧月，王娟，等.小劑量氯胺酮、瑞芬太尼在嬰幼兒唇腭裂手術(shù)中的麻醉效果觀察［J］.山東醫(yī)藥，2009，49(38):103-104.

［4］Ikonomidou C，Bosch F，Miksa M，et al.Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain［J］.Science，1999，283(5398):70-74.

［5］Hayashi H，Dikkes P，Soriano SG.Repeated Administration of Ketamine May lead to Neuronal Degeneration in the Developing Rat Brain［J］.Paediatric Anaesthesia，2002，12(9):770-774.

［6］Shi Q，Guo L，Patterson TA，et al.Gene expression profiling in the developing rat brain exposed to ketamine［J］.Neuroscience，2010，166(3):852-863.