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    串珠素在咀嚼肌中的表達及意義

    2012-07-31 09:22:58王彥亮黃志鋒周稚輝麻健豐
    山東醫(yī)藥 2012年35期
    關鍵詞:串珠骨骼肌條帶

    朱 莉,王彥亮,黃志鋒,何 帥,周稚輝,麻健豐

    (1溫州醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院,浙江溫州 325027;2溫州醫(yī)學院藥學院;3解放軍第118醫(yī)院)

    細胞外機制(ECM)是由纖維性蛋白質(zhì)、氨基多糖和蛋白聚糖等生物大分子組成的動態(tài)網(wǎng)絡結構,在維持生物結構的完整性、細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞表型、功能的調(diào)節(jié)中均具有重要作用。串珠素是ECM中主要的蛋白聚糖成分,廣泛存在多種組織基底膜和軟骨基質(zhì)中,與其他基質(zhì)成分緊密結合并自行組成二聚體和其他的大聚合物。大量體外研究發(fā)現(xiàn),串珠素在細胞生長和分化、組織化等方面發(fā)揮多種功能,可以通過調(diào)節(jié)生長因子的結合和活性,影響血管壁細胞、軟骨和骨細胞等多種細胞在發(fā)育期的增殖、遷移,并影響細胞與基質(zhì)的黏附,在機體心血管系統(tǒng)和軟骨發(fā)育,血管、骨骼系統(tǒng)和神經(jīng)肌接頭(NMJ)的生成與功能調(diào)控等多種生命過程中均具有重要作用。2010年5月~2011年12月,我們對串珠素基因片段進行克隆、擴增和蛋白表達,以獲取串珠素蛋白,并探討其在咀嚼肌中的表達特點。

    1 材料與方法

    1.1 材料 探針載體直接轉(zhuǎn)化,擴增,酶切,測序后,酶切片段,插入pET32a,表達,測序,表達全菌蛋白,Wetstern blot 1—測 his,Western blot 2—測抗串珠素,2次均在同一分子量處發(fā)現(xiàn)表達。牛串珠素基因(b串珠素)探針為Ray Rodgers教授(Reproductive Medicine Unit,Obstetrics & Gynaecology,Adelaide University,SA,AUSTRALIA,5005)惠贈,全長183 bp,連接于pGEM-T Easy載體。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 目的基因擴增和鑒定 用b串珠素-pGEMT Easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(質(zhì)粒0.1 μg,DH5α 感受態(tài)菌200 μL,冰浴30 min后42 ℃熱休克90 s,),涂布于(含 Amp 100 μg/mL)的 LB 平板上,37℃培養(yǎng)過夜。挑陽性菌,將陽性細菌在含Amp的瓊脂培養(yǎng)基中劃板,挑取單克隆菌落接種于含Amp LB培養(yǎng)液中37℃振蕩過夜。擴增后,用堿裂解法提取質(zhì)粒,酚/氯仿抽提回收質(zhì)粒,EcoR I+Sal I酶切,瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定,并送DNA測序。

    1.2.2 目的基因克隆和表達 將測序正確的串珠素片段插入到表達載體 pET32a中(DNA片段2.5 μL,載體 2.5 μL,0.1 M MgCl20.5 μL,Sal I 5 μL,16℃,4 h),轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,接種于AMP+LB平板。37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)4 h?;厥召|(zhì)粒,酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定。DNA測序鑒定。鑒定正確后,挑選1%轉(zhuǎn)化后的細菌接種在新鮮的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期,0.2 mM IPTG誘導4 h,收菌,SDS-PAGE分析鑒定。以pET32a空載體轉(zhuǎn)化和未經(jīng)誘導的細菌設為對照組。

    1.2.3 融合蛋白表達檢測 采用Western blot法。表達全菌蛋白SDS-PAGE,200 mA低溫轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉封閉1 h后,鼠抗His抗體(1∶1 000)4℃封閉過夜。PBST(PBS中加入0.1%Tween-20)洗膜3次,每次10 min;羊抗鼠二抗(1∶5 000)封閉1 h;PBST洗膜3次,每次10 min;PBS洗膜3次,每次5 min;發(fā)光,顯影。陰性對照為pET32a誘導和未誘導菌蛋白。再次行Western blot,一抗采用鼠抗串珠素單抗,檢測融合蛋白表達情況。陰性對照仍然設為pET32a誘導和未誘導菌蛋白。

    1.2.4 b串珠素抗血清制備 對雄性新西蘭家兔進行常規(guī)體檢,將重組的串珠素核心蛋白500 μg用PBS稀釋至1 mL,與等體積的Freund完全佐劑充分乳化后,在家兔皮下注射1 mL,7 d后再次在雙后腿淋巴結內(nèi)注射100 μg抗原以加強免疫。以后每隔10 d進行一次加強免疫,5 W后取家兔全血,4℃過夜,4 000 r/min,4 ℃離心10 min,收集血清,-20 ℃保存。配置0.1 g/L瓊脂糖凝膠,行雙向免疫擴散試驗,測定抗體滴度。

    1.2.5 免疫組化實驗 將成年大鼠脫頸處死,立即取材面部咀嚼肌,多聚甲醛固定過夜,梯度酒精脫水,石蠟包埋,5 μm石蠟切片。串珠素多克隆抗體工作濃度為1∶100,二抗為羊抗兔IgG(SABC免疫組化試劑盒,博士德公司,武漢),工作濃度為1∶100。切片脫蠟至水,在室溫下用H2O2處理30 min,PBS洗5 min×2次,胰蛋白酶消化37℃ 30 min,PBS洗5 min×3次,50 mL/L正常羊血清封閉10 min,PBS洗5 min×3次。加一抗,對照組用正常羊血清代替一抗,4℃過夜。PBS洗5 min×3次,加二抗,37℃30 min。PBS洗5 min×3次,加SABC 37℃ 30 min。PBS洗5 min×3次,DAB顯色,蘇木素輕度復染。脫水,透明,封片,光鏡觀察。

    2 結果

    2.1 串珠素擴增和插入到表達載體后酶切電泳質(zhì)粒擴增后酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳顯示在100~200 bp間有新條帶出現(xiàn)(見圖1)(DNA marker:SD012)。擴增后所獲得的片段送DNA測序(寶泰克公司),測序結果與原序列相同,說明擴增正確。將測序正確的串珠素片段插入到表達載體pET32a中,EcoR I+Sal I酶切后電泳鑒定,在100~200 bp處有穩(wěn)定電泳條帶出現(xiàn),顯示串珠素片段插入到pET32a中的連接反應正確(DNA marker:DGL2000,見圖2)。

    圖1 b串珠素擴增后酶切電泳圖

    圖2 串珠素片段插入到表達載體pET32a后酶切電泳圖

    2.2 串珠素蛋白表達和分析 SDS-PAGE顯示在IPTG誘導的串珠素-pET32a轉(zhuǎn)化菌蛋白有新條帶出現(xiàn),新條帶的分子量在35 kD附近,說明IPTG誘導下插入pET32a的串珠素可以進行高效的蛋白表達。對照組分別為未經(jīng)IPTG誘導的串珠素-pET32a轉(zhuǎn)化菌和用pET32a空載體的轉(zhuǎn)化菌蛋白。Western blot示,未誘導的菌無表達,而融合蛋白的和pET32a轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導后均有蛋白表達,其中融合蛋白條帶相對分子質(zhì)量大于pET32a誘導的蛋白條帶,說明插入pET32a載體的蛋白成功表達(見圖4)。

    圖3 SDS-PAGE分析串珠素表達

    圖4 Western blot顯示的融合蛋白表達

    2.3 免疫組化染色結果 光鏡下觀察,串珠素在咀嚼肌中表達顯著,均勻分布在骨骼肌肌纖維細胞外的基質(zhì)中,尤其在肌膜處明顯聚集呈帶狀分布(圖5)。

    圖5 串珠素在骨骼肌中的分布

    3 討論

    串珠素是ECM中主要的蛋白聚糖之一[1],分子量約為700 kD,由核心蛋白和4條硫酸肝素(HS)側鏈組成,與其他基質(zhì)成分緊密結合并自行組成二聚體和大的聚合物。串珠素主要存在于骨、軟骨、血管、牙胚中,介導著細胞增殖分化及細胞信號轉(zhuǎn)導等[2,3]。組織來源不同的串珠素硫肝素側鏈不同,不同種屬的哺乳動物類串珠素核心蛋白序列上有同源性,不同組織細胞來源的串珠素側鏈結構差別較大,側鏈的變化對于其生物學活性具有明顯的影響。串珠素側鏈的HS帶有負電,通過其吸水性增加組織的容積,可以結合、釋放生長因子,使生長因子暫時失活,并在必要時恢復其活性,不僅具有生長因子儲存庫的作用,也是細胞黏附分子的重要配體。

    骨骼肌再生是一個至今仍未完全被理解的過程,運動神經(jīng)與骨骼肌間建立突觸連接的位置是運動神經(jīng)與肌細胞相互誘導來確定的,長期以來肌纖維周圍的基膜一直被認為是這種調(diào)控作用的重要因素,但具體機制了解較少。近年來,隨著對NMJ中ACh受體(AChR)復合體研究的深入,揭示出基膜中的多種硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)在此過程中起主導作用。運動神經(jīng)末梢通過釋放的神經(jīng)遞質(zhì)可誘導突觸后膜上信號蛋白的積聚,使AChR復合體定位在突觸后膜上,其中串珠素是該過程中最重要的一種信號蛋白,被認為是AChR復合體在運動終板突觸后膜上定位的信號分子[4]。串珠素在NMJ處高表達,是NMJ處乙酰膽堿酯酶(AChE)的獨特受體分子,在把AChE定位在突觸基膜上的過程中發(fā)揮主要的作用[5]。AChE復合體在突觸后膜的定位是通過串珠素結合AChE和dystroglycan來達到的[6]。體外實驗已證實,在運動神經(jīng)—肌肉共培養(yǎng)模型中,串珠素的存在能夠明顯促進二者間的相互誘導生長及突觸的形成。在NMJ形成后,串珠素還繼續(xù)對維持突觸的穩(wěn)定發(fā)揮作用[7]。同時,串珠素還參與了骨骼肌再生過程中的復雜的調(diào)控機制,因其是細胞表面和ECM的主要成分,調(diào)控生長因子活性并影響細胞生長和分化[8]。

    骨骼肌損傷后,變性的肌纖維釋放出多種信號,浸潤的炎細胞和重塑的ECM均能影響修復性肌形成的過程。在多種信號存在的情況下,衛(wèi)星細胞活化、肌前體細胞的增生和分化等一系列過程都需要密切調(diào)控。Casar等[9]報道了注射氯化鋇誘導產(chǎn)生的小鼠骨骼肌細胞再生過程中觀察的HSPG表達情況,發(fā)現(xiàn)有幾種HSPG出現(xiàn)暫時性上調(diào),包括syndecan-3、glypican、串珠素和syndecan-4。這些HSPG的表達增加與分化過程中早期標志物的表達相一致,并定位于新形成的肌管中。對缺血或毒性損傷,新形成的肌纖維在最初的基膜管中發(fā)育,這樣可以讓NMJ在原來的突觸位置形成。這種基膜位置信息的儲存依賴于HSPG,如agrin或串珠素。串珠素、glypican、syndecan-3和 probably syndecan-4是伴隨新形成的正在分化的肌管能被原位檢測到的幾種主要HSPG。體外結合試驗證實,ECM組蛋白H1能特異性結合串珠素,二者共同存在于再生的骨骼肌中,包括肌管培養(yǎng)基和再生骨骼肌的ECM。組蛋白H1與串珠素結合能顯著刺激成肌細胞的增生[10]。

    本實驗設計通過基因工程方法表達串珠素核心蛋白,并制備特異性多克隆抗體,用以檢測串珠素在咀嚼肌等口腔組織中的表達和分布。本研究首先完成了對b串珠素基因的正確克隆和表達,建立了可以表達b串珠素的組織工程菌。pET32a載體上串珠素插入?yún)^(qū)的上游有His蛋白的表達序列,可作為在Western blot中檢測pET32a表達的標記。在以鼠抗His抗體作為一抗進行Western blot檢測時,融合蛋白的和pET32a轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導后均有蛋白表達,其中融合蛋白條帶相對分子質(zhì)量大于pET32a誘導的蛋白條帶;而在以鼠抗串珠素為一抗進行Western blot檢測中,只有融合蛋白轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導后有蛋白表達,證明串珠素-pET32a轉(zhuǎn)化菌蛋白能表達串珠素,并能與鼠抗串珠素特異性結合。

    本實驗通過條件誘導方法實現(xiàn)了串珠素核心蛋白的原核表達,而其較復雜的蛋白糖基化過程需要通過真核動物細胞表達來實現(xiàn)。用anti-串珠素單抗進行的Western blot表明原核表達的串珠素核心蛋白具有天然串珠素的免疫原性。因此本實驗的方法僅是利用其具有的免疫原性來實現(xiàn)抗體制備,而不能用來產(chǎn)生活性蛋白。免疫沉淀實驗證明了用其制備的多克隆血清可對串珠素核心蛋白產(chǎn)生特異性結合。另外,免疫組化實驗表明牛與鼠串珠素的免疫原性之間存在交叉,應為哺乳動物間串珠素序列的同源性所致。

    串珠素通過參與基底膜成分的結合與組裝,對于維持基底膜結構與功能的完整性發(fā)揮著極其重要的作用。串珠素廣泛表達在咀嚼肌的ECM中,其中在肌膜等ECM的膜性結構中更是集中表達。

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