烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇后兔腦組織氧化應(yīng)激損傷的影響*

夏金明，胡春林，李 欣，李 慧，魏紅艷，李穎慶，廖曉星，荊小莉△

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510080;2杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，浙江 杭州 310015)

隨著人口老齡化，心腦血管病已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)最主要、最常見的疾病之一，心臟性猝死(sudden cardiac death，SCD)也隨之成為中老年患者死亡的重要原因，而有效的心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resus-citation，CPR)是成功搶救這類患者的首要步驟。盡管由于CPR新指南的出臺(tái)、復(fù)蘇技術(shù)的發(fā)展和公眾CPR技術(shù)的普及，SCD病人的自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation，ROSC)率得到了顯著提高，成功率可達(dá)20%～50%［1］，然而僅有2%～15%的病人能存活出院［2］，大多數(shù)病人死于CPR后全腦缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，即使幸免存活者，其中40%～50%也伴有不同程度的神經(jīng)功能障礙和缺失［3］。因此，腦復(fù)蘇是CPR成功的關(guān)鍵。

氧化應(yīng)激損傷是CPR后腦損傷的主要機(jī)制之一［4］，而核因子 E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2－related factor 2，Nrf2)是機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激最重要的細(xì)胞防御機(jī)制［5］。Nrf2通過(guò)與胞漿蛋白 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白－1(Kelch－like epichlorohydrinassociated protein 1，KEAP1)以及抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，啟動(dòng)下游編碼抗氧化蛋白和 II相解毒酶的基因表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［6］。我們前期的研究表明烏司他丁(ulinastatin，UTI)可減輕 CPR 后腦損傷［7］，但其具體機(jī)制還不清楚。本文從UTI對(duì)CPR后氧化應(yīng)激的影響探討UTI的腦保護(hù)作用機(jī)制，類似研究國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。

材料和方法

1 動(dòng)物與分組

56只雄性新西蘭成年大白兔，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前晚禁食不禁水。實(shí)驗(yàn)1:8只新西蘭兔建立CA模型，ROSC后24 h內(nèi)連續(xù)采血監(jiān)測(cè)血漿丙二醛(malondialdehyde，MDA)和還原型谷胱甘肽 (glutathione，GSH)水平。實(shí)驗(yàn)2:48只新西蘭兔建立CA模型，ROSC后隨機(jī)分為模型組(model組)和UTI組，每組分別于ROSC后2 h、4 h和8 h取大腦皮層和海馬，測(cè)定MDA和GSH含量，檢測(cè)Nrf2激活情況;其余動(dòng)物存活72 h后取大腦皮層和海馬，TUNEL法檢測(cè)原位細(xì)胞凋亡。

2 主要試劑及設(shè)備

MDA和GSH測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建程生物工程研究所;TUNEL凋亡試劑盒購(gòu)自Roche;BCA法蛋白定量試劑盒、核/胞漿蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;戊巴比妥鈉購(gòu)自Sigma;Nrf2試劑盒購(gòu)自Abcam;UTI購(gòu)自廣州天普生化醫(yī)藥股份有限公司。小動(dòng)物呼吸機(jī)(RODENT VENTILATOR 683.Harvard Apparatus);4道生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)(BIOPAC SYSTEMS MAP150，Inc.MP100A －CE Santa Barbara);動(dòng)物除顫儀(SAN－ei Cardiopace 3MII)。

3 方法

3.1 術(shù)前準(zhǔn)備 戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經(jīng)兔左耳緣靜脈注入，麻醉成功后，胸部備皮。選擇3.0號(hào)氣管導(dǎo)管經(jīng)口氣管插管，常規(guī)Ⅱ?qū)?lián)心電監(jiān)護(hù)，小號(hào)留置針穿刺右耳動(dòng)脈，接高敏感換能器監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓。心電圖和動(dòng)脈血壓通過(guò)4道生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)連續(xù)記錄在電腦上。

3.2 建立CPR模型 按照本課題組前期的研究方法建立室顫－CPR模型［8－10］。采用經(jīng)胸體表交流電(6 V，50 Hz)誘發(fā)室顫，誘發(fā)時(shí)間5～10 s。成功誘發(fā)室顫的標(biāo)準(zhǔn)為:心電監(jiān)護(hù)顯示室顫波形，血壓迅速下降，接近0 mmHg。室顫持續(xù)5 min后開始CPR，行心前區(qū)胸外心臟按壓，頻率為200次/min，深度為胸腔前后徑的1/3;同時(shí)接呼吸機(jī)，通氣頻率為45次/min，潮氣量約10 mL/kg(根據(jù)血?dú)夥治鼋Y(jié)果調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，使PCO2控制在35～45 mmHg之間)。復(fù)蘇期間每3 min給予腎上腺素20 μg/kg。按壓2 min后給予電除顫，選擇能量為20～30 J。如15 min未恢復(fù)自主循環(huán)，終止實(shí)驗(yàn)。判斷ROSC成功的標(biāo)準(zhǔn)為:恢復(fù)自主心律，平均動(dòng)脈壓大于60 mmHg并持續(xù)30 min以上。UTI組動(dòng)物ROSC后立即給予UTI 10×104U/kg一次性經(jīng)左耳緣靜脈注入，而model組只給予等體積的生理鹽水注入。ROSC后維持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均動(dòng)脈血壓大于60 mmHg，補(bǔ)充生理需要的能量。ROSC后所有動(dòng)物維持機(jī)械通氣2～3 h，斷開呼吸機(jī)后如呼吸節(jié)律規(guī)則且血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，并持續(xù)1 h以上，停機(jī)械通氣。ROSC后不予以維持麻醉。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照UTSTEIN模式記錄。

3.3 血漿MDA和GSH水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)1組動(dòng)物分別于復(fù)蘇前、ROSC 后 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、5 h、7 h、9 h、12 h、18 h 和 24 h 從左耳緣靜脈采血，離心后取上清用硫代巴比妥酸(thibabituric acid，TAB)法測(cè)定血漿MDA，用二硫代二硝基苯甲酸［5，5’－dithiobis(2－nitrobenzoic acid)，DTNB］法測(cè)定GSH。

3.4 腦組織MDA和GSH含量測(cè)定 ROSC后2 h、4 h和8 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)各取4只兔并取其大腦皮層和海馬，組織勻漿后用BCA法測(cè)定勻漿蛋白濃度，并測(cè)定MDA和GSH含量，計(jì)算出每毫克組織中MDA和GSH的含量。

3.5 Western blotting檢測(cè)Nrf2蛋白水平 處理不同時(shí)段腦組織凍存標(biāo)本，按照核/胞漿蛋白提取試劑盒說(shuō)明，提取胞漿蛋白和核蛋白，BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，按濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，滴加Ⅰ抗(1∶1000)4℃過(guò)夜，TBST洗膜，5 min×3次，滴加HRB標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶3000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜，5 min×3次，Milipore發(fā)光液浸泡1 min，Koda膠片曝光，顯影、定影，計(jì)算蛋白灰度。

3.6 腦組織凋亡神經(jīng)元計(jì)數(shù) ROSC后72 h過(guò)量麻醉處死動(dòng)物，取大腦皮層和海馬組織，用4%甲醛固定，做石蠟切片后TUNEL法原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)，在光鏡400倍視野下，計(jì)數(shù)100×100像素內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，依據(jù)正態(tài)檢驗(yàn)(Kolmogorov－Smirnov)結(jié)果數(shù)據(jù)分別用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()或中位數(shù)(第1四分位數(shù)，第3四分位數(shù))表示，用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)(Mann－Whitney rank)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 致顫及ROSC情況

實(shí)驗(yàn)1中8只動(dòng)物，均致顫成功，有6只存活至ROSC后24 h。實(shí)驗(yàn)2中48只動(dòng)物，均致顫成功，ROSC后2、4和8 h，每組各時(shí)點(diǎn)均分別處死4只動(dòng)物，取材。Model組和UTI組各有6只存活到ROSC后72 h。2組動(dòng)物的生理學(xué)參數(shù)如體重(body weight，BW)、心率(heart rate，HR)、呼吸頻率(respiratory rate，RR)、平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)和復(fù)蘇相關(guān)的指標(biāo)如基礎(chǔ)生命支持時(shí)間(basic life support，BLS)、除顫次數(shù)(defibrillation times，DF－T)、腎上腺素(adrenaline，AD)用量之間沒(méi)有顯著差異，見表1、2。

表1 2組動(dòng)物CPR前一般生理參數(shù)Table 1.Physiological parameters in the two groups before CPR(.n=18)

表1 2組動(dòng)物CPR前一般生理參數(shù)Table 1.Physiological parameters in the two groups before CPR(.n=18)

Group BW(kg) HR(min－1) RR(min－1) MAP(mmHg)Model 2.39±0.33 251.37±51.37 43.32±4.68 83.83±17.98 UTI 2.43±0.19 270.73±28.31 42.45±5.39 84.63±10.11

表2 2組動(dòng)物CPR相關(guān)指標(biāo)Table 2.CPR－related indicators in the two groups(.n=18)

表2 2組動(dòng)物CPR相關(guān)指標(biāo)Table 2.CPR－related indicators in the two groups(.n=18)

Group BLS(min) DF－T AD(μg)Model 2.16 ±1.81 1(0，2)126.53 ±63.04 UTI 2.56 ±1.25 1(0，2)132.91 ±59.52

2 ROSC后24 h內(nèi)血漿MDA和GSH的變化

ROSC后血漿MDA迅速升高，在ROSC后1.5～2 h左右達(dá)到峰值水平(195.51±23.57)μmol/L，見圖1A，ROSC后血漿GSH明顯下降，在ROSC后2 h達(dá)到最低谷［(69.89±14.53)mmol/L］，見圖1B。

Figure 1.The changes of plasma MDA(A)and GSH(B)levels in 24 h after ROSC..n=6.圖1 ROSC后24 h內(nèi)血漿MDA和GSH的變化

3 ROSC后2 h、4 h和8 h腦組織MDA和GSH的含量

ROSC后2 h、4 h和8 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)2組動(dòng)物大腦皮層與海馬MDA含量見表3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UTI組ROSC后腦組織MDA含量明顯低于model組，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 ROSC后2 h、4 h和8 h兔腦組織MDA含量Table 3.The concentration of MDA in rabbit brain tissues at 2 h，4 h and 8 h after ROSC［μmol/(g protein)..n=4］

表3 ROSC后2 h、4 h和8 h兔腦組織MDA含量Table 3.The concentration of MDA in rabbit brain tissues at 2 h，4 h and 8 h after ROSC［μmol/(g protein)..n=4］

*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs model group.

Hippocampus 2 h 4 h 8 h 2 h 4 h 8 h Model 17.28 ±1.43 14.75 ±1.20 12.12 ±1.24 17.1 Group Cortex 9 ±1.35 13.42 ±4.27 12.21 ±1.83 UTI 13.05 ±1.25＊＊ 11.51 ±0.68＊＊ 8.71 ±0.92＊＊ 13.02 ±1.19＊＊ 10.95 ±1.00* 7.59 ±1.92＊＊

ROSC后2 h、4 h和8 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)2組動(dòng)物大腦皮層與海馬GSH含量見表4，UTI組ROSC后腦組織GSH含量明顯高于model組，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 ROSC后2 h、4 h和8 h兔腦組織GSH含量Table 4.The concentration of GSH in rabbit brain tissues at 2 h，4 h and 8 h after ROSC［mmol/(g protein)..n=4］

表4 ROSC后2 h、4 h和8 h兔腦組織GSH含量Table 4.The concentration of GSH in rabbit brain tissues at 2 h，4 h and 8 h after ROSC［mmol/(g protein)..n=4］

＊＊ P ＜0.01 vs model group.

Hippocampus 2 h 4 h 8 h 2 h 4 h 8 h Model 1.97 ±0.58 1.59 ±0.36 1.22 ±0.24 2.22 ±0.Group Cortex 74 1.76 ±0.72 1.02 ±0.34 UTI 4.36 ±1.00＊＊ 3.61 ±0.86＊＊ 3.05 ±0.90＊＊ 4.59 ±0.53＊＊ 3.88 ±0.36＊＊ 3.13 ±0.32＊＊

4 Western blotting檢測(cè)Nrf2蛋白水平

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，ROSC后2、4和8 h model組胞核/胞漿Nrf2蛋白表達(dá)分別為0.91±0.08、0.87±0.04和 0.79±0.09，明顯低于同時(shí)段UTI組(1.07±0.06、1.04±0.09和0.98±0.07，均P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of Nrf2 in the cortex of rabbits after ROSC..n=4.*P＜0.05 vs model group.圖2 ROSC后兔大腦皮層Nrf2蛋白的表達(dá)

5 ROSC后72 h大腦皮層及海馬內(nèi)神經(jīng)元凋亡情況

ROSC后72 h 2組大腦皮層凋亡神經(jīng)元數(shù)目model組為8.8±1.5，UTI組為5.7±1.0，P ＜0.01。海馬CA1～CA3區(qū)model組凋亡神經(jīng)元數(shù)目分別為17.2±1.2、13.5 ±2.1和17.3±2.7，明顯多于 UTI組(14.2±1.5、11.0±0.9和13.7±1.6，P＜0.05或P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3.The apoptosis of neurons in cortex and hippocampus CA1～CA3 areas after ROSC 72 h(TUNEL staining，×400)..n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖3 ROSC后72 h大腦皮層和海馬CA1～CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡情況

討 論

CA后機(jī)體血液循環(huán)近乎停止，全身各臟器和組織處于極為嚴(yán)重的缺血缺氧狀態(tài)，經(jīng)過(guò)有效及時(shí)的心肺復(fù)蘇，ROSC后全身血運(yùn)得以重建，但機(jī)體又將會(huì)面臨新的傷害，即再灌注損傷［11］。大腦血液循環(huán)豐富，耗氧量也是全身最多的器官，因此CA會(huì)對(duì)腦組織產(chǎn)生極為嚴(yán)重的影響和后果，而神經(jīng)元損傷會(huì)選擇性出現(xiàn)在一些對(duì)缺血再灌注極為敏感的腦區(qū)，如海馬、丘腦網(wǎng)狀核和大腦皮層［3］等部位，而氧化應(yīng)激損傷則是CPR后繼發(fā)性腦損傷的主要機(jī)制之一［4］。

氧自由基會(huì)引起生物體內(nèi)尤其是腦組織蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷［12］，導(dǎo)致體內(nèi)氧化與抗氧化作用平衡失調(diào)，產(chǎn)生MDA等大量過(guò)氧化降解產(chǎn)物，破壞細(xì)胞膜，引起線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能改變，加重細(xì)胞能量代謝障礙，反過(guò)來(lái)促進(jìn)新自由基的產(chǎn)生，周而復(fù)始，最終導(dǎo)致了神經(jīng)元凋亡和壞死［13］。氧自由基還可使細(xì)胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease－activating factor 1，Apaf－1)等釋放增加，通過(guò)多條途徑導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡［3］。

在實(shí)驗(yàn)1中我們發(fā)現(xiàn)新西蘭兔歷經(jīng)5 min的室顫以及隨后2～5 min的CPR，自主循環(huán)恢復(fù)后血漿中MDA明顯增高，在ROSC后2 h達(dá)到峰值水平，而體內(nèi)重要的抗氧化劑GSH在CPR后有所下降，在ROSC后2 h達(dá)到最低谷。上述結(jié)果表明CA后機(jī)體出現(xiàn)了明顯的氧化應(yīng)激損傷，氧化產(chǎn)物大量產(chǎn)生，抗氧化物質(zhì)明顯減少，兩者之間動(dòng)態(tài)平衡被完全打破。因此，盡早干預(yù)ROSC后的失控性氧化應(yīng)激損傷可能會(huì)給CA病人帶來(lái)益處。

UTI是一種強(qiáng)力的蛋白酶抑制劑，可抑制多種酶的活性，能通過(guò)多種途徑阻滯炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的中間環(huán)節(jié)，減少TNF－α等致炎因子及介質(zhì)的釋放［14］，抑制氧自由基的生成，降低血腦屏障通透性，減輕腦水腫，從而保護(hù)腦細(xì)胞［15－16］。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)2中觀察UTI對(duì)ROSC后不同時(shí)點(diǎn)大腦皮層、海馬內(nèi)MDA、GSH含量的變化和對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響，結(jié)果表明UTI明顯減少ROSC后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腦皮層及海馬內(nèi)MDA含量、提高GSH含量。因此，我們認(rèn)為UTI可顯著抑制兔ROSC后大腦皮層和海馬MDA水平，提高GSH含量，加強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化能力，維持氧化與抗氧化之間的平衡，保護(hù)大腦皮層及海馬神經(jīng)元。

Nrf2是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子。在生理狀態(tài)下，Nrf2與KEAP1以二聚體的形式存在于細(xì)胞漿中［6］。在基礎(chǔ)條件下，絕大部分Nrf2以非活性狀態(tài)儲(chǔ)存于細(xì)胞質(zhì)中，與 KEAP1相偶聯(lián)，后者與胞漿肌動(dòng)蛋白結(jié)合而被錨定在胞漿，通過(guò)泛素介導(dǎo)的蛋白降解系統(tǒng)維持Nrf2的基礎(chǔ)水平;另一部分Nrf2以活性狀態(tài)存在于細(xì)胞核中介導(dǎo)基因的基本轉(zhuǎn)錄。泛素化的Nrf2很快被26S蛋白酶體降解，使Nrf2通路關(guān)閉，抑制26S蛋白酶可能使Nrf2在細(xì)胞核堆積，持續(xù)開放Nrf2通路［17］。26S蛋白酶是泛素化酶系統(tǒng)的重要成員，缺血再灌注后26S蛋白酶被激活，廣泛參與組織損傷，抑制其激活可減輕組織損傷，保護(hù)缺血性心肌損傷［18－20］，UTI可能通過(guò)抑制26S蛋白酶，減少Nrf2降解，促進(jìn)其轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)。在實(shí)驗(yàn)2中Western blotting結(jié)果顯示Nrf2蛋白表達(dá)在ROSC后2 h、4 h和8 h UTI組 Nrf2的胞核/胞漿比明顯高于model組，表明CPR后UTI可促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與ARE相互作用，啟動(dòng)下游的抗氧化蛋白、II相解毒酶、蛋白酶體和分子伴侶等基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［21］，發(fā)揮其抗氧化作用，保護(hù)全身組織器官免受缺血再灌注帶來(lái)的氧化損傷，減少神經(jīng)元凋亡。

UTI已被廣泛應(yīng)用于臨床，但在CPR后用于預(yù)防繼發(fā)性腦損傷的研究還比較少，我們的研究表明UTI可升高ROSC后兔腦組織GSH水平，降低MDA含量，增加Nrf2的表達(dá)，減少神經(jīng)元的凋亡，為UTI用于預(yù)防CPR后繼發(fā)性腦損傷的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)，其有效性還有待臨床研究來(lái)證實(shí)。

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