5b對人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7ADR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用

郭 榮 趙 瑛

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)院普通外科,山西太原 030001

臨床上，乳腺癌是一種女性常見的疾病，且發(fā)病率有逐年上升的趨勢。乳腺癌細(xì)胞中存在大量的多藥耐藥細(xì)胞株(MDR)，MDR能顯著降低化療藥物的敏感性，影響化療的治療效果[1]。板藍(lán)根是菘藍(lán)的根，其提取出來的活性物質(zhì)具有較強的免疫激活功能，能顯著增強化療藥物阿霉素等的敏感性，增加化療藥物在癌細(xì)胞中的蓄積，提高藥效，而且其對細(xì)胞的毒副作用小。本文主要研究板藍(lán)根提取物5 b對乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF－7ADR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及逆轉(zhuǎn)機理，為乳腺癌的治療提供依據(jù)。

1 儀器及細(xì)胞株

1.1 儀器來源

活性單體－5 b為天津中醫(yī)藥大學(xué)提供，主要采用溶劑浸提法從中藥板藍(lán)根中分離提純獲得，純度高達(dá)98%。阿霉素及碘化吡啶由北京中山醫(yī)藥公司提供；1640細(xì)胞培養(yǎng)基、流式細(xì)胞儀由上海明治公司提供；CO2培養(yǎng)箱及顯微鏡由北京生物公司提供。

1.2 細(xì)胞株來源

人乳腺癌細(xì)胞株MCF－7及其耐藥細(xì)胞株MCF－7/ADR由中山腫瘤醫(yī)院實驗室提供，MCF－7/ADR細(xì)胞株的耐藥倍數(shù)是MCF－7細(xì)胞株的80倍。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF－7細(xì)胞及MCF－7/ADR細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)液在1640細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中有100U/mL的鏈霉素、100U/mL的青霉素、12%的小牛血清；培養(yǎng)環(huán)境中有5%的CO2、保持在37℃左右、濕度適宜，2d進(jìn)行一次傳代。

2.2 MTT法檢測[2]

本研究采用MTT法檢測活性單體－5 b對 MCF－7細(xì)胞及MCF－7/ADR細(xì)胞生長的安全濃度，并觀察MCF－7/ADR的多藥耐藥細(xì)胞株MDR生長的抑制功能及逆轉(zhuǎn)作用。耐藥倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)根據(jù)以下公式確定：耐藥倍數(shù)＝IC50(MCF－7/ADR細(xì)胞株)/IC50(MCF－7細(xì)胞株)，本研究中MCF－7/ADR細(xì)胞株的耐藥倍數(shù)是MCF－7細(xì)胞株的80倍；逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝IC50(阿霉素作用組)/IC50(活性單體－5b與阿霉素作用組)。

2.3 FCM法檢測[3]

本研究采用FCM 法檢測MCF－7細(xì)胞及MCF－7/ADR細(xì)胞的凋亡率，并觀察細(xì)胞中阿霉素的含量。細(xì)胞中阿霉素含量的測定方法：蒽環(huán)類藥物一般都會發(fā)出熒光，可以采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞中阿霉素的含量進(jìn)行測定。選取106個對數(shù)生長期的細(xì)胞,加入2.4 mg/L的活性單體－5 b以及5 μmol/L的阿霉素，在 37℃的保溫箱中保溫1 h，將細(xì)胞收集后調(diào)整轉(zhuǎn)速為1500 rpm進(jìn)行2 min的離心處理，采用新的DMEM培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行清洗；再放入37℃保溫箱中進(jìn)行10 min左右的保溫，再次采用新的DMEM培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行清洗，放在新的、冰冷的DMEM培養(yǎng)液中使用488nm的激發(fā)光對細(xì)胞的熒光強度進(jìn)行檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用Cell Quest Plot軟件對細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計量，組間均數(shù)比較t檢驗。P＜0.05時，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 MTT法檢測結(jié)果

采用 MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，在MCF－7細(xì)胞及 MCF－7/ADR細(xì)胞中加入低于150μmol/L的活性單體－5 b時，活性單體－5 b對兩種細(xì)胞均無毒副作用。IC50（MCF－7 細(xì)胞）＝（0.14±0.02），IC50（MCF－7/ADR 細(xì)胞）＝（15.74±0.08）,耐藥倍數(shù)均為 112。將 2 種細(xì)胞加入150μmol/L以下濃度的的活性單體－5 b中培養(yǎng)48 h后，MCF－7細(xì)胞及MCF－7/ADR細(xì)胞的IC50均有不同程度的下降，但MCF－7/ADR細(xì)胞的IC50下降更為明顯，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)增高明顯，且逆轉(zhuǎn)倍數(shù)隨著活性單體－5 b濃度的增加而增高，與之相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)率也升高明顯，2種細(xì)胞逆轉(zhuǎn)倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），比較見表 1。

表1 活性單體-5b對2種細(xì)胞的IC50作用及耐藥逆轉(zhuǎn)比較（s）

表1 活性單體-5b對2種細(xì)胞的IC50作用及耐藥逆轉(zhuǎn)比較（s）

MCF－7 MCF－7/ADR逆轉(zhuǎn)倍數(shù)逆轉(zhuǎn)率0.14±0.02 15.74±0.08－ －0.12±0.04 14.29±0.01 1.20 9.28 0.21±0.04 11.03±0.03 1.44 30.18 0.13±0.05 7.18±0.10 2.18 54.88 0.10±0.01 2.33±0.02 6.68 85.97

4.2 FCM法檢測結(jié)果

4.2.1 細(xì)胞凋亡率 在MCF－7細(xì)胞及MCF－7/ADR細(xì)胞中加入阿霉素與活性單體－5b共同作用后，F(xiàn)CM法檢測發(fā)現(xiàn)，與MCF－7細(xì)胞的凋亡率相比，MDR的凋亡率升高的速度更快，見表2。在150 μmol/L以下濃度的的活性單體－5 b范圍內(nèi)，隨著活性單體－5b濃度的增加，MDR的凋亡率升高的速度隨之加快，凋亡率增加差異比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 活性單體-5b對MCF-7細(xì)胞及MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡率影響比較（s）

表2 活性單體-5b對MCF-7細(xì)胞及MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡率影響比較（s）

MCF－7 MCF－7/ADR 1.82±0.06 1.17±0.04 2.04±0.10 3.14±0.08 1.97±0.10 5.36±0.12 3.26±0.04 9.04±0.02 5.06±0.02 21.84±0.03

4.2.2 阿霉素含量變化情況 FCM法觀察發(fā)現(xiàn)，MCF－7細(xì)胞在加入不同濃度的活性單體－5 b時阿霉素?zé)晒鈴姸鹊母淖儾町惐容^無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）；MCF－7/ADR 細(xì)胞在加入 15.8、31.5 μmol/L兩種濃度的活性單體－5 b時，阿霉素?zé)晒鈴姸鹊母淖儾町悷o統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05），但是在加入 63.0、125 μmol/L 2 種濃度的活性單體－5 b時，阿霉素?zé)晒鈴姸让黠@增加，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。 由此可見，在加入 63.0 μmol/L 以上，150 μmol/L 以下的活性單體－5 b的情況下，阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積含量增加，對MDR的殺傷力也隨之增強。

5 討論

人體乳腺癌的多藥耐藥（MDR）能明顯降低化療藥物的敏感性，影響化療的效果，MDR數(shù)量的增多還可能導(dǎo)致化療失敗，因此在乳腺癌的治療中應(yīng)采取措施對MDR進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，以提高化療藥物的敏感性。中藥中有很多可以增加化療藥物敏感性的成分，如板藍(lán)根提取物5 b就是其中的一種。板藍(lán)根提取物中的活性單體5 b具有較強的免疫激活功能，并能在體外抑制癌細(xì)胞的活性?；钚詥误w－5 b作為一種親脂化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與MDR逆轉(zhuǎn)劑的化學(xué)特征較為相似，能起到良好的逆轉(zhuǎn)作用。

在研究中我們發(fā)現(xiàn)，在阿霉素中加入活性單體－5 b，阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積含量增加，而阿霉素對MCF－7細(xì)胞以及MCF－7/ADR細(xì)胞的抑制作用也有所增強，特別是MCF－7/ADR細(xì)胞的凋亡率明顯提升，這對乳腺癌的治療帶來新的希望。

[1]董寧寧,王明玉,張瓊.吉西他濱聯(lián)合卡培他濱治療蒽環(huán)類和紫杉類藥物耐藥的轉(zhuǎn)移性乳腺癌臨床療效分析 [J].腫瘤防治研究,2010,13(1):67－68.

[2]張鳳春,樓麗廣,唐衛(wèi)東,等.托瑞米芬和他莫昔芬對MCF7/ADR多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2009,81(9):54－55.

[3]Toshiaki Saeki,Takashi Tsuruo,Wakao Sato,et al.Drug resistance in chemotherapy for breast cancer[J].2008.