小分子效應物對生物法生產壬二酸的影響

孫弘宇，于 濤，于 平

(中國石油大慶煉化公司，黑龍江 大慶 163411)

根據(jù)有關生物代謝途徑，由于烷烴在水中的溶解度很小，菌體如何攝取到足夠量的烷烴是影響菌體生物轉化烷烴生產壬二酸的關鍵。烷烴被菌體吸收后，菌體代謝烷烴的核心是α、β、ω氧化，要提高壬二酸的產量必須促進α、ω氧化，抑制β氧化。作者在此研究了生物法生產壬二酸的過程中吐溫-80、乙酸鈉、丙烯酸、苯巴比妥等小分子效應物對壬二酸產率的影響。

1 實驗

1.1 出發(fā)菌種

熱帶假絲酵母。

1.2 方法

1.2．1 吐溫-80對壬二酸產率的影響

在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，加入不同量的吐溫-80，發(fā)酵結束后補水至原體積，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來研究吐溫-80對壬二酸產率的影響。

1.2.2 乙酸鈉對壬二酸產率的影響

在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，加入不同量的乙酸鈉，發(fā)酵24 h，測定菌液OD值；繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵結束后補水至原體積，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來研究乙酸鈉對壬二酸產率的影響。

1.2.3 丙烯酸對壬二酸產率的影響

將丙烯酸稀釋10倍，單獨滅菌。發(fā)酵24 h時，將不同量丙烯酸加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中；繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵結束后補水至原體積，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來研究丙烯酸對壬二酸產率的影響。

1.2.4 苯巴比妥對壬二酸產率的影響

在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，加入不同量的苯巴比妥，發(fā)酵結束后補水至原體積，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來研究苯巴比妥對壬二酸產率的影響。以不加苯巴比妥、且種子培養(yǎng)時未加入烷烴為對照組。

分別在種子培養(yǎng)開始時、發(fā)酵開始時、發(fā)酵12 h后加入0.2%苯巴比妥，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來確定苯巴比妥的最佳加入時間。

2 結果與討論

2.1 吐溫-80對壬二酸產率的影響

熱帶假絲酵母轉化烷烴的第一步是將細胞外的烷烴轉運到胞內，這一步是利用菌株對烷烴的親和力和乳化能力來實現(xiàn)的。

本實驗通過加入乳化劑吐溫-80來考察菌體吸收烷烴的效果。吐溫-80對壬二酸產率的影響見圖1。

圖1 吐溫-80對壬二酸產率的影響

由圖1可以看出，加入0.05%的吐溫-80，壬二酸產率達到最高；隨著吐溫-80添加量的增大，反而不利于產酸，壬二酸產率下降。這可能是因為，吐溫-80是菌體代謝的中間產物，加入少量的吐溫-80，能促進烷烴和水的乳化，有利于菌體攝取烷烴，故能提高壬二酸的產率；但吐溫-80添加量過多，抑制了作為中間產物的乳化劑的產生，導致菌體攝取烷烴量不足，反而不利于產酸。

2．2 乙酸鈉對壬二酸產率的影響

乙酸基團與乙酰CoA有相似處，且可作為菌體的碳源，添加適量的乙酸鈉有利于壬二酸的積累。乙酸鈉對壬二酸生長和產率的影響見圖2。

圖2 乙酸鈉對壬二酸生長和產率的影響

由圖2可以看出，添加乙酸鈉不僅能夠促進菌體的生長而且有利于壬二酸產率的提高，但乙酸鈉添加量超過1.5%后，壬二酸的產率反而下降。這說明，乙酸鈉促進產酸是由于菌體量增加的緣故；當乙酸鈉添加量超過1.5%后，由于高濃度的乙酸鈉對菌體α、ω氧化有抑制作用，且抑制作用大于菌體量的增加，所以壬二酸產率反而下降。

2．3 丙烯酸對壬二酸產率的影響

據(jù)報道[1]，丙烯酸能抑制脂肪酸的β氧化。丙烯酸對壬二酸產率的影響見圖3。

圖3 丙烯酸對壬二酸產率的影響

由圖3可以看出，將0.10%的丙烯酸加入到培養(yǎng)基中能使壬二酸產率提高20%左右。這可能是由于，丙烯酸的加入，有效地抑制了菌體的β氧化，從而降低菌體分解壬二酸的能力，有利于壬二酸的積累；但過高濃度的丙烯酸卻抑制菌體的生長，使菌體的α、ω氧化也受到抑制，反而降低了壬二酸的產率。

2．4 苯巴比妥對壬二酸產率的影響

據(jù)報道[2]，烷烴能誘導細胞色素 P450完整的酶系，且P450酶的誘導量與烷烴濃度呈正相關。同時有研究發(fā)現(xiàn)，苯巴比妥也能明顯誘導細胞色素 P450酶的生成[3]。苯巴比妥對壬二酸產率的影響見圖4。

圖4 苯巴比妥對壬二酸產率的影響

由圖4a可以看出，加入苯巴比妥與加入烷烴的產率相近，說明苯巴比妥與烷烴一樣能誘導細胞色素 P450酶的生成。當苯巴比妥的添加量為0.1%～0.3%時，壬二酸的產率較高(圖4b)。

雖然加入的烷烴可以進一步被微生物轉化為壬二酸，并對發(fā)酵液中提取精制純品影響小，但從成本上考慮，苯巴比妥的最適添加量為0.2%(25 g苯巴比妥價格不超過10.0元)，而烷烴的最適添加量為5%，成本較高。因此，選擇加入0.2%的苯巴比妥。

在不同時刻加入0.2%苯巴比妥的壬二酸產率見圖5。

圖5 苯巴比妥加入時刻對壬二酸產率的影響

由圖5可以看出，在發(fā)酵開始時加入苯巴比妥，壬二酸的產率最高(達61.1 g·L-1)，說明此時的誘導效果最好。因此，選擇發(fā)酵開始時加入苯巴比妥。

3 結論

發(fā)酵過程中小分子效應物對壬二酸產率的影響較大：添加少量吐溫-80有利于菌體吸收和轉化烷烴；乙酸鈉、丙烯酸均能抑制菌體的β氧化；苯巴比妥與烷烴一樣能誘導P450酶的產生，明顯有利于壬二酸的生物轉化，在發(fā)酵開始時添加0.2%的苯巴比妥效果最好，壬二酸的產率可達61.1 g·L-1。

參考文獻：

[1] 劉樹臣，李蘭，方向晨.十三碳二元羧酸發(fā)酵技術的研究[J].微生物學報，2000，40(3)：318-322.

[2] 譚余慶，霍海如.苯巴比妥鈉誘導細胞色素P450對內毒素所致鼠毒性的保護作用[J].中國藥學雜志，2001，36(2)：97-100.

[3] 焦鵬，華玉濤，李書良，等.熱帶假絲酵母轉化烷烴過程中P450酶活的研究[J].微生物學報，2001，41(1)：117-120.