黑曲霉蘋果酸酶基因的敲除及其功能研究

尹升明,耿紅冉，周 闖，劉 浩

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.中國生物技術(shù)發(fā)展中心，北京 100039)

黑曲霉在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值，不僅廣泛應(yīng)用于食品、藥物和工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)，同時(shí)也是表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞工廠[1]。黑曲霉基因組測序已完成，大約包括3400萬個(gè)堿基，為基礎(chǔ)和應(yīng)用性研究提供了極大的便利，但黑曲霉大部分基因功能仍是未知的[2]，因此對黑曲霉的研究不能僅依賴于生物信息學(xué)，更需要采用分子生物學(xué)手段對其基因功能進(jìn)行研究[3]。

蘋果酸酶(Malic enzyme，ME)廣泛存在于自然界中[4～6]，是調(diào)控蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶，可以催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)。線粒體中的NAD-ME催化丙酮酸脫羧，在TCA循環(huán)中起重要作用[7]。采用分子生物學(xué)探討ME基因在黑曲霉中的功能將為研究蘋果酸代謝及其輔酶再生奠定基礎(chǔ)[8]。

作者在此利用農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化黑曲霉，通過同源重組敲除黑曲霉ME基因，篩選ME基因敲除菌株，對其進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)來研究ME基因在TCA循環(huán)中的作用，并對ME基因敲除菌株的生長、發(fā)育和代謝進(jìn)行了深入研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

黑曲霉野生型菌株，編號(hào)ATCC1015，由中科院天津工業(yè)微生物研究所孫際濱實(shí)驗(yàn)室提供；農(nóng)桿菌AGL1、大腸桿菌(E.coli)DH5α、質(zhì)粒p44(由pCAMBIA1300改造而來)，均自行保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨 10，酵母浸出物 5，NaCl 10。固體培養(yǎng)基加瓊脂 20 g·L-1[9]。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：稱取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加1000 mL水煮沸30 min，用雙層紗布濾成清液，加水至1000 mL，然后加入20 g葡萄糖完全溶解，pH值自然。固體培養(yǎng)基加瓊脂20 g[10]。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)及真菌完全培養(yǎng)基(CM)參照文獻(xiàn)[11]配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖50，NH4NO32.5，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 1.0，NaCl 1.0，CaCl20.1，酵母浸出物 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0005，ZnSO4·7H2O 0.0005，CuSO4·5H2O 0.00025[9]。

1.1.3 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶HindⅢ、PstⅠ、BamHⅠ、KpnⅠ、T4DNA ligase、Taq DNA Polymerase，F(xiàn)ermentas公司；KOD FX，東洋紡(上海)生物科技有限公司；PCR產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，OXOID公司；其它試劑均為國產(chǎn)色譜純。

1.1.4 引物

本實(shí)驗(yàn)所用黑曲霉菌株為A.nigerATCC1015，其基因組測序工作已于2006年完成，并在http://genome.jgi-psf.org/公布，本實(shí)驗(yàn)所涉及到的與ME基因相關(guān)序列均通過該網(wǎng)站獲得。采用的引物見表1。

表1 PCR引物

注：上述引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成

1.2 方法

1.2.1ME基因敲除質(zhì)粒p44-ME::hyg的構(gòu)建

首先以A.nigerATCC1015的基因組為模板，利用引物ME-upf/ME-upr、ME-downf/ME-downr進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到ME基因的5′端片段及3′端片段。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。然后將5′端片段與p44質(zhì)粒分別酶切(BamHⅠ/KpnⅠ)后連接得到p44-ME1，將3′端片段與p44-ME1用HindⅢ/PstⅠ酶切后連接得到p44-ME::hyg。最后將p44-ME::hyg分別用BamHI/KpnⅠ與HindⅢ/PstⅠ酶切驗(yàn)證。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的質(zhì)粒p44-ME::hyg轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1[12]，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上活化至OD=0.8后，取100 μL該菌液與等量的黑曲霉孢子(1×107個(gè)·mL-1)滴加在0.45 μm醋酸纖維素膜上，然后將膜貼在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含200 μmol·L-1AS和100 μg·mL-1Kanamycin)上，30 ℃培養(yǎng)48～72 h。

1.2.3ME基因敲除菌株的篩選鑒定

將共培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(CM+200 μmol·L-1Cefotaxine+200 μg·mL-1Hygromycin)上，30 ℃培養(yǎng)4～5 d，得到黑曲霉轉(zhuǎn)化子。然后在PDA液體培養(yǎng)基中30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2～3 d，得到菌絲體。采用苯酚-氯仿抽提法提取基因組，通過常規(guī)PCR擴(kuò)增篩選出ME基因敲除菌株。PCR所用聚合酶為KOD FX。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min。

1.2.4 目的菌株的發(fā)酵

發(fā)酵罐規(guī)格為貝朗A plus 5 L，裝液量為4 L。采用孢子接種，接種量為5×108個(gè)·mL-1，初始pH值2.5，轉(zhuǎn)速 200 r·min-1，通氣量0.3 vvm；孢子萌發(fā)后(大約16 h)pH值4.5，轉(zhuǎn)速 600 r·min-1，通氣量1 vvm。用1 mol·L-1NaHCO3與2 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH值[13]。每隔12 h取樣檢測。

1.2.5 發(fā)酵液中有機(jī)酸含量的測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定。取發(fā)酵液2 mL通過0.22 μm微孔濾膜過濾得到清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)用于液相色譜分析。使用Bio-Rad Aminex?HPX-87H有機(jī)酸專用液相色譜柱；有機(jī)酸含量采用紫外檢測器檢測，檢測波長為210 nm；甘油及殘?zhí)呛坎捎靡暡顧z測器檢測；流動(dòng)相為5 mmol·L-1硫酸溶液；流速0.6 mL·min-1；柱溫65 ℃；進(jìn)樣量10 μL[14]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中相關(guān)物質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 ME蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測及曲霉家族ME蛋白序列比對(圖1)

黑曲霉基因組數(shù)據(jù)預(yù)測ME基因編碼含666個(gè)氨基酸的蛋白，Broadinstitute預(yù)測該蛋白中含有一個(gè)N-端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖1a)。

從基因組數(shù)據(jù)庫中獲取曲霉家族ME蛋白序列并采用clustalx1.83軟件進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白在曲霉屬中相似度均大于85%，說明該蛋白在曲霉屬中十分保守(圖1b)。

圖1 ME蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測及曲霉家族ME蛋白序列比對

2.2 敲除質(zhì)粒p44-ME::hyg的構(gòu)建

采用苯酚-氯仿抽提法提取黑曲霉ATCC1015基因組，用作常規(guī)PCR的模板，分別擴(kuò)增黑曲霉ME基因的上下游各1.0 kb的片段，并將它們分別連接到質(zhì)粒p44潮霉素基因的上下游，得到敲除質(zhì)粒p44-ME::hyg(圖2a)。將p44-ME::hyg分別用BamHⅠ/KpnⅠ與HindⅢ/PstⅠ進(jìn)行酶切，各得到一條1.0 kb左右的條帶，分別為連接到質(zhì)粒上的ME基因的上下游同源臂,說明 p44-ME::hyg構(gòu)建成功，是需要的含有同源臂的敲除質(zhì)粒(圖2b)。

M.Marker 1.Bam HⅠ/Kpn Ⅰ酶切 2.Hin dⅢ/Pst Ⅰ酶切

2.3 ME基因敲除菌株的篩選與鑒定

在共培養(yǎng)過程中，同源序列可能發(fā)生交換，產(chǎn)生敲除菌株(圖3a)。共培養(yǎng)物在篩選培養(yǎng)基上生長出轉(zhuǎn)化子，選擇30株單獨(dú)培養(yǎng)，得到菌絲體，提取DNA并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到1株敲除菌株△ME。提取野生株和突變株基因組，利用ME-upf1/ME-downr1進(jìn)行引物PCR驗(yàn)證，野生株(圖3b 1#泳道)有一條1.2 kb左右的目的條帶，而突變株(圖3b 2#泳道)沒有(后面引物所在部分被潮霉素基因取代了)；利用ME-upf1/ME-hyg引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，突變株(圖3b 4#泳道)有一條1.2 kb左右的目的條帶，而野生株(圖3b 3#泳道)則沒有(野生株沒有潮霉素基因)。

這些表明菌株△ME即為敲除ME基因后的突變菌株。

M.Marker 1.ME-upf1/ME-downr1，WT 2.ME-upf1/ME-downr1,△ME 3.ME-upf1/ME-hyg，WT 4.ME-upf1/ME-hyg,△ME

2.4 菌體和殘?zhí)堑臏y定

將野生株與△ME突變株單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)，每隔12 h取樣檢測菌體干重與殘?zhí)橇浚Y(jié)果見圖4。

圖 4 發(fā)酵過程曲線

由圖4可看出，野生株與△ME突變株的菌體生長狀況相似，并且殘?zhí)橇恳卜浅＝咏?，說明ME基因的敲除對菌體生長的影響并不明顯。

2.5 發(fā)酵過程代謝物含量的測定

將野生株與△ME突變株單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)96 h，每12 h取一次樣，將菌液通過0.22 μm濾膜過濾，采用HPLC測定代謝物含量，結(jié)果見圖5。

圖5 代謝物最高產(chǎn)量

由圖5可看出，與野生株相比，△ME突變株檸檬酸、草酸、丙酮酸以及蘋果酸的產(chǎn)量沒有明顯變化，說明ME基因的敲除對代謝影響不大。

2.6 討論

雖然不同生物體中ME有不同的生理功能，但它們的氨基酸序列卻高度保守。根據(jù)大腸桿菌MaeB的氨基酸序列，可以推測出它含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中N-端結(jié)構(gòu)域和NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)樘O果酸酶所特有；C-端結(jié)構(gòu)域與沒有蘋果酸酶活性但能夠催化乙?；恨D(zhuǎn)化成正磷酸鹽的PTA(Phosphotransacetylases)同源[15]。

卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)中的蘋果酸酶被認(rèn)為是該真菌中生物合成多不飽和脂肪酸所需要的重要酶，它持續(xù)為脂肪酸合成酶進(jìn)行鏈延伸提供NADPH[6]。在植物的TCA循環(huán)過程中，線粒體中NAD-ME催化丙酮酸脫羧[7]。在對擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，NADP-ME只在特定的發(fā)育階段發(fā)揮作用[16]。

3 結(jié)論

將黑曲霉中的ME基因敲除之后獲得1株ME基因敲除的突變株。對突變株進(jìn)行發(fā)酵研究，發(fā)現(xiàn)其TCA循環(huán)各種有機(jī)酸、檸檬酸、草酸、丙酮酸以及蘋果酸的產(chǎn)量與野生株相比沒有明顯變化，說明ME基因的敲除對代謝并沒有產(chǎn)生明顯影響。在真菌中，由于其代謝系統(tǒng)的復(fù)雜性，如在TCA循環(huán)中存在很多代謝支路及其代謝相關(guān)的酶，單個(gè)基因敲除后對代謝的影響可能不是很大。

參考文獻(xiàn)：

[1] Baker S E.Aspergillusnigergenomics：Past，present and into the future[J].Medical Mycology，2006，44(S1)：17-21.

[2] Pel H J，de Winde J H，Archer D B，et al.Genome sequencing and analysis of the versatile cell factoryAspergillusnigerCBS 513.88[J].Nature Biotechnology，2007，25(2):221-231.

[3] Michielse C B，Hooykaas P J,van de Hondel C A，et al.Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi[J].Current Genetics，2005，48(1):1-17.

[4] Chang G G，Tong L.Structure and function of malic enzymes，a new class of oxidative decarboxylases[J].Biochem，2003，42(44):12721-12733.

[5] Detarsio E，Andreo C S，Drincovich M F.Basic residues play key roles in catalysis and NADP+-specificity in maize(ZeamaysL.) photosynthetic NADP+-dependent malic enzyme[J].Biochem J，2004，382(Pt3)：1025-1030.

[6] Wynn J P，Hamid A B A，Ratledge C.The role of malic enzyme in the regulation of lipid accumulation in filamentous fungi[J].Microbi，1999，145(8)：1911-1917.

[7] Song Y D，Wynn J P，Li Y H，et al.A pre-genetic study of the isoforms of malic enzyme associated with lipid accumulation inMucorcircinelloides[J].Microbi，2001，147(6)：1507-1515.

[8] Dolezal P，Vanacova S，Tachezy J，et al.Malic enzymes ofTrichomonasvaginalis：Two enzyme families，two distinct origins[J].Gene，2004，329：81-92.

[9] Michielse C B，Ram A F J，Hooykaas P J J，et al.Agrobacterium-mediated transformation ofAspergillusawamoriin the absence of full-length VirD2，VirC2，or VirE2 leads to insertion of aberrant T-DNA structures[J].Journal of Bacteriology，2004，186(7):2038-2045.

[10] Sugui J A，Chang Y C，Kwon-Chung K J.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation ofAspergillusfumigatus：An efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption[J].Applied and Environmental Microbiology，2005，71(4):1798-1802.

[11] Michielse C B，Hooykaas P J，van den Hondel C A,et al.Agrobacterium-mediated transformation of the filamentous fungusAspergillusawamori[J].Nature Protocols，2008，3(10)：1671-1678.

[12] den Dulk-Ras A，Hooykaas P J J.Electroporation ofAgrobacteriumtumefaciens[J].Methods of Molecular Biology，1995，55：63-72.

[13] Roukas T.Carob pod：A new substrate for citric acid production byAspergillusniger[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，1998，74(1)：43-53.

[14] Samragy Y A，Khorshid M A，F(xiàn)oda M I,et al.Effect of fermentation conditions on the production of citric acid from cheese whey byAspergillusniger[J].International Journal of Food Microbiology，1996，29(2-3)：411-416.

[15] Marchler-Bauer A，Anderson J B,Cherukuri P F,et al.A conserved domain database for protein classification[J].Nucleic Acids Res，2005,33:192-196.

[16] Wheeler M C G，Tronconi M A，Drincovich M F,et al.A comprehensive analysis of the NADP-malic enzyme gene family ofArabidopsis[J].Plant Phy，2005，139(1)：39-51.