大腸桿菌高密度培養(yǎng)研究進(jìn)展

黎鴻平，黃海嬋，鐘衛(wèi)鴻

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

隨著基因重組技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的外源基因得以在微生物中表達(dá)，以便大量快捷地獲得外源基因產(chǎn)物或改變微生物的代謝特性。與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，E.coli表達(dá)系統(tǒng)因具有易培養(yǎng)、遺傳學(xué)背景清楚、表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短等特點，成為目前應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。

工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵的基本目標(biāo)是以最低的成本獲得最高的細(xì)胞或其產(chǎn)物收益，因此大規(guī)模高密度培養(yǎng)微生物的技術(shù)和工藝變得越來越重要。E.coli的高密度培養(yǎng)技術(shù)(HCDC)正是在這樣的一種需求下而發(fā)展起來的一門重要技術(shù)。E.coli高密度培養(yǎng)是一個相對概念，一般是指E.coli在液體培養(yǎng)時菌體干細(xì)胞質(zhì)量(Dry cell weight，DCW)達(dá)50 g·L-1以上時的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)。據(jù)Riesenberg[1]報道，在考慮了培養(yǎng)條件和營養(yǎng)物質(zhì)等因素后，大腸桿菌菌體密度理論上限值能達(dá)到200 g·L-1。高密度培養(yǎng)涉及到培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件等諸多方面。

作者在此就大腸桿菌高密度培養(yǎng)的影響因素、培養(yǎng)方法及基因工程技術(shù)在大腸桿菌高密度培養(yǎng)中的最新應(yīng)用進(jìn)行簡要綜述。

1 大腸桿菌高密度培養(yǎng)的影響因素

1.1 菌種

不同的E.coli菌株由于自身代謝系統(tǒng)的不同，在培養(yǎng)條件、對外界環(huán)境耐受能力等方面都存在著較大的差異。例如E.coliK系列菌株和E.coliB系列菌株均為較常用的培養(yǎng)菌株，但E.coliB菌株在高密度培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的乙酸要比E.coliK少。van de Walle等[2]對E.coliBL21(DE3)和E.coliK(JM109)進(jìn)行了乙酸代謝研究，發(fā)現(xiàn)前者的乙酸積累僅為后者的1/4，菌體密度也高出25%。

1.2 接種量

接種量會影響菌體在發(fā)酵罐中的生長速度。較大的接種量可以縮短菌體生長達(dá)到最高值的時間，這是因為種子液中含有大量胞外水解酶類，有利于菌體對基質(zhì)的快速充分利用，縮短生長延遲期。胡爽等[3]在200 L發(fā)酵罐中，將接種量由5%增加至10%，最終菌體密度由44.2 g·L-1提高至53.9 g·L-1。但是接種量過大也會使菌體生長過快，菌體生長持續(xù)的時間縮短，自溶也較快，反而影響后期的生長。因此，接種時應(yīng)根據(jù)菌體具體的生長情況確定接種量。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 碳源

不同微生物對碳源的需求各不相同，碳源的種類和濃度對菌體的生長代謝也有不同的影響。葡萄糖是E.coli最易利用的碳源，也是E.coli發(fā)酵中最常用的碳源。但葡萄糖濃度超過50 g·L-1后就會抑制E.coli的生長，因此，保持基質(zhì)中適當(dāng)?shù)妮^低的碳源濃度是E.coli高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵。李民等[5]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中初糖濃度為10 g·L-1時，菌體密度和產(chǎn)物表達(dá)量均獲得了較好的效果。但以葡萄糖作為碳源易產(chǎn)生代謝抑制物質(zhì)——乙酸，而有研究表明以甘油代替葡萄糖作為E.coli生長的碳源可以減少乙酸的積累，更易達(dá)到高密度[6]。Medaglia等[7]在發(fā)酵過程中補加麥芽糖和甘油，菌體密度和產(chǎn)物量都提高了2.5倍。

1.3.2 氮源

大量研究表明應(yīng)對發(fā)酵過程中的氮源加以控制，氮源濃度過高對菌體的生長和產(chǎn)物的表達(dá)合成都可能產(chǎn)生負(fù)面影響。培養(yǎng)E.coli時常用氨水作為主要的氮源，在培養(yǎng)過程中以流加的方式加入培養(yǎng)液，既可用來充當(dāng)?shù)从挚捎脕碚{(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，但氨水加入過多會導(dǎo)致細(xì)胞的產(chǎn)率下降[8]。碳氮比也是影響E.coli生長的重要因素：當(dāng)碳氮比過高時，菌體生長代謝緩慢，菌體利用營養(yǎng)物質(zhì)主要用于合成積累代謝產(chǎn)物；當(dāng)碳氮比較低時，菌體利用營養(yǎng)物質(zhì)主要用于自身的生長，菌體初期生長繁殖旺盛，導(dǎo)致代謝廢物增多，發(fā)酵液粘度增大，進(jìn)而影響溶氧，使菌體后期生長受到抑制并造成菌體提前衰老自溶。

1.3.3 微量元素

E.coli對鈣、鈷、鐵、鋁、錳、錫等微量元素的需求量雖然很小，但微量元素對微生物的生長及活性所起的作用不可忽視，尤其是在高密度培養(yǎng)時更應(yīng)在培養(yǎng)基中添加適量的微量元素。朱才慶等[9]在培養(yǎng)E.coliDA19時發(fā)現(xiàn)，在基本培養(yǎng)基中添加混合微量元素能大大改善菌體生長。

1.4 培養(yǎng)條件

1.4.1 溫度

溫度對E.coli的生長繁殖有很大的影響。在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，E.coli比生長速率變大；但溫度進(jìn)一步升高，E.coli比生長速率反而會減小。E.coli的最適生長溫度為37 ℃，但在近期的一些研究中，經(jīng)常以低于37 ℃的溫度來培養(yǎng)E.coli，當(dāng)培養(yǎng)溫度從37 ℃下降至30 ℃左右時，可使細(xì)胞的營養(yǎng)物攝入率和比生長速率減小，減少有害抑制產(chǎn)物(主要是乙酸)的積累和代謝熱的產(chǎn)生[10]。Ohta等[11]在培養(yǎng)重組E.coliKS467時，通過將溫度從37 ℃降低到30 ℃，成功地將發(fā)酵液中乙酸的濃度從10 g·L-1降至5 g·L-1。程立坤等[12]在32 ℃下培養(yǎng)E.coli時，通過控制比生長速率在0.3 h-1以下，使乙酸濃度降至0.90 g·L-1，菌體密度達(dá)到53.42 g·L-1。

1.4.2 溶氧

氧是一種難溶氣體，常溫常壓下氧在純水中的溶解度僅為7 mg·L-1。因此溶氧很容易成為E.coli高密度培養(yǎng)的限制因素，尤其是在高密度培養(yǎng)的后期，發(fā)酵液中菌體密度很大，耗氧量極大。溶氧濃度較高時，比生長速率就會增大，使菌體大量繁殖生長；當(dāng)溶氧濃度超過一定限度時，菌體的比生長速率反而減小，而且還會導(dǎo)致乙酸積累增多，葡萄糖的單位得率反而下降[13]。在高密度培養(yǎng)時，可以通過提高發(fā)酵通氣量、攪拌速度、通入純氧等方法來控制溶氧；還可以通過使用氧溶解度高的載體來提高溶氧，如動物來源的血紅蛋白和長鏈的烴等化合物。另外，將能夠提高氧傳遞能力的透明顫藻血紅蛋白(VHB)基因克隆并在菌體中表達(dá)，也能取得不錯的效果[14]。

1.4.3 pH值

1.5 有害副產(chǎn)物

E.coli利用葡萄糖產(chǎn)生的主要有害物質(zhì)是乙酸，尤其是在較大的比生長速率或供養(yǎng)不足時；但當(dāng)E.coli在葡萄糖過量的條件下生長時，即使氧充足也會產(chǎn)生乙酸[16]。乙酸的積累對E.coli生長繁殖會產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)其濃度大于5 g·L-1時，菌體生長緩慢，菌體得率和最大可達(dá)細(xì)胞密度均下降；當(dāng)其濃度超過14 g·L-1時，菌體停止生長[10]。

Han等[17]認(rèn)為，細(xì)菌在比生長速率較小時通過氧化代謝過程產(chǎn)生的能量足以滿足其生長生理的需求，便不會產(chǎn)生乙酸；而在比生長速率較大時，大腸桿菌通過氧化代謝不能產(chǎn)生足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑提供ATP和NADH2。因此，為減少乙酸的積累，可以通過調(diào)節(jié)限制性底物(如葡萄糖)的供應(yīng)來控制比生長速率低于臨界值。研究表明，比生長速率超過0.35 h-1時就會產(chǎn)生乙酸[10]，故一般控制比生長速率在0.1～0.35 h-1之間比較合適，但應(yīng)根據(jù)不同的情況選擇合適的比生長速率才能達(dá)到高密度培養(yǎng)。另外，通過提高乙酸利用率也能有效減少培養(yǎng)液中乙酸的積累。Oh等[18]認(rèn)為，乙酸的分解代謝是在許多酶的作用下完成的，而在通常情況下，葡萄糖對這些酶具有抑制作用，所以在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中這些酶是以失活狀態(tài)存在的。因此，解除這種抑制作用的突變株在利用消耗葡萄糖的同時會不斷地分解消耗培養(yǎng)基中存在的乙酸[19]。

另外，通過優(yōu)化培養(yǎng)基、降溫培養(yǎng)、透析培養(yǎng)等方法都可以有效地降低乙酸的積累。

2 大腸桿菌高密度培養(yǎng)的方法

E.coli高密度培養(yǎng)的方法主要是補料分批培養(yǎng)。作為目前應(yīng)用最廣泛、最成熟的培養(yǎng)技術(shù)，補料分批培養(yǎng)是一種介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的補料方法，是在分批培養(yǎng)過程中間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，以達(dá)到延長菌體生長期和控制培養(yǎng)過程的目的。補料方法分為非反饋補料和反饋補料。

2.1 非反饋補料

非反饋補料主要包括恒速補料、變速補料、指數(shù)補料等。

恒速補料是以恒定的速率流加限制性基質(zhì)的碳源。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，相對于培養(yǎng)液中的菌體來說，營養(yǎng)濃度是逐漸降低的，菌體的比生長速率也慢慢減小，但菌體能夠得到持續(xù)的生長，培養(yǎng)液中菌體量在培養(yǎng)過程中是線性增加的。

變速補料是指在培養(yǎng)過程中，營養(yǎng)物質(zhì)的補加速率以階段性或線性等方式不斷加快或減慢。當(dāng)菌體濃度較高或菌體生長旺盛時，就加快補料速度，加入更多營養(yǎng)物促進(jìn)細(xì)胞的生長繁殖從而實現(xiàn)高密度；反之，就減慢補料速度。李民等[5]采用三階段式流加葡萄糖的方法培養(yǎng)重組菌生產(chǎn)骨形成蛋白，取得了較好的效果。Son等[20]采用線性提速補料的方法培養(yǎng)重組大腸桿菌生產(chǎn)SOD，細(xì)胞得率為17.6 g·L-1。

指數(shù)補料是一種簡單而又有效的補料方式，它能使培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物的濃度控制在較低的水平，可以有效地減少乙酸等有害代謝物的積累，使菌體密度以一定的比生長速率呈指數(shù)形式增加(比生長速率通常維持在0.1～0.35 h-1之間)。Korz等[6]采用指數(shù)補料方式，以葡萄糖和甘油為碳源培養(yǎng)重組E.coli，菌體密度分別達(dá)到了128 g·L-1及148 g·L-1。孫艷等[21]采用分階段控制比生長速率的指數(shù)補料策略培養(yǎng)E.coliJM109，有效緩解了單一比生長速率情況下溶氧不能無限制地增加的問題，控制培養(yǎng)液中乙酸濃度在2.53 g·L-1左右，細(xì)胞密度(OD600)達(dá)到91.2。

2.2 反饋補料

反饋補料分為恒溶氧法、恒pH值法、CER(CO2排放率)法等。

表1就幾種常用的反饋和非反饋補料方法進(jìn)行了比較。

由表1可以看出，反饋補料能夠根據(jù)反饋的信息及時調(diào)整補料的速率和策略，但具有一定的滯后性，不能完全避免糖濃度的波動和代謝副產(chǎn)物的積累；而非反饋補料也存在不能根據(jù)發(fā)酵環(huán)境的變化和菌體生長的具體情況作出反饋調(diào)節(jié)的缺點。因此，如何結(jié)合各補料方法的優(yōu)點同時摒棄其缺點，找到一種新的、更有效的補料方法成為近期研究的熱點和突破點。Restaino等[24]在培養(yǎng)E.coliK4產(chǎn)莢膜多糖時，采用在發(fā)酵前期用指數(shù)補料、在發(fā)酵后期用微孔過濾的分階段混合補料方法，取得了較好的效果，菌體濃度達(dá)到36.4 g·L-1，多糖產(chǎn)量達(dá)到4.33 g·L-1。Biener等[25]在培養(yǎng)重組E.coliTB1時，建立了一套以菌體生長過程中產(chǎn)生的熱量為依據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)補料，從而更加準(zhǔn)確和持續(xù)地控制菌體的比生長速率的培養(yǎng)調(diào)控模型，為大腸桿菌的高密度培養(yǎng)提供了新的方向。

表1 高密度培養(yǎng)流加補料方法的比較

2.3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在補料調(diào)控中的應(yīng)用

由于發(fā)酵過程涉及生命體的生長和繁殖，機理復(fù)雜，具有高度的非線性、時變性和不確定性，同時過程參數(shù)的測量時間長、精度差，因而很難建立適當(dāng)?shù)挠嬎隳Ｐ蛠砻枋霭l(fā)酵過程[26]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)由于具有很強的非線性映射能力，它通過網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部權(quán)值的調(diào)整來擬合系統(tǒng)的輸入輸出關(guān)系，即只根據(jù)輸入輸出數(shù)據(jù)來建立模型，可以反映十分復(fù)雜的非線性關(guān)系，因而很適合于多因變量、多自變量統(tǒng)計中的建模，可以相當(dāng)準(zhǔn)確地模擬系統(tǒng)行為[27]，所以，近年來人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)在發(fā)酵過程的控制、優(yōu)化等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

Duan等[28]在培養(yǎng)E.coliK12時，根據(jù)DO-STAT法和pH-STAT法獲得的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建模和訓(xùn)練，用于溶氧和pH值變化模式的識別，進(jìn)而辨識葡萄糖是過量還是不足，以便更加準(zhǔn)確地控制補料速率，使發(fā)酵罐中的葡萄糖控制在適合的水平，既不積累代謝副產(chǎn)物又能使菌體以最大的比生長速率生長，提高了菌體密度和外源蛋白的表達(dá)量，取得了較好的效果，菌體濃度達(dá)到53 g·L-1。

3 基因工程技術(shù)在大腸桿菌高密度培養(yǎng)中的應(yīng)用

基因工程技術(shù)在E.coli高密度培養(yǎng)中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下兩方面：

(1)阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑：通過切斷碳源生成乙酸的主要代謝通路，可以顯著減少乙酸產(chǎn)生。E.coli產(chǎn)生乙酸的途徑有兩條：一是在丙酮酸氧化酶的作用下，直接由丙酮酸產(chǎn)生乙酸，但在E.coli中此酶的活性很低，產(chǎn)生的乙酸很少；另一條是在乙酸激酶(Ack)和磷酸轉(zhuǎn)乙?；?Pta)的作用下，將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸，這是E.coli產(chǎn)生乙酸的主要途徑。因此通過敲除Pta或Ack基因，使E.coli中合成乙酸的主要途徑受阻，就能有效地減少培養(yǎng)液中乙酸的積累[29]。

(2)改變代謝路徑以減少乙酸的形成：由于代謝溢流的存在，在高密度培養(yǎng)過程中當(dāng)葡萄糖濃度過高時，菌體攝取的葡萄糖有部分會通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生乙酸。因此，研究人員通過改變菌體的葡萄糖代謝途徑，使菌體攝取的碳源更多地流向其自身的結(jié)構(gòu)和功能物質(zhì)的合成、減少流向乙酸合成的途徑，從而減少乙酸的產(chǎn)生。Soto等[30]通過構(gòu)建代謝工程菌，使葡萄糖在半乳糖透性酶和葡萄糖激酶的作用下代謝分解，取代原有的磷酸烯醇式丙酮酸的代謝途徑，用100 g·L-1的初始葡萄糖濃度培養(yǎng)野生型E.coliW3110和代謝工程菌E.coliVH33，結(jié)果顯示：E.coliW3110產(chǎn)生的乙酸濃度達(dá)到5.3 g·L-1，而E.coliVH33產(chǎn)生的乙酸濃度只有2 g·L-1。Knabben等[31]用初始濃度為130 g·L-1的葡萄糖培養(yǎng)代謝工程菌，使培養(yǎng)液中乙酸的濃度降至0.5 g·L-1左右。

4 結(jié)語

目前，人們對大腸桿菌高密度培養(yǎng)進(jìn)行了大量的研究，并取得了許多成就：了解了許多影響其高密度培養(yǎng)的因素；研究了多種不同的補料方式。同時，隨著培養(yǎng)控制手段的進(jìn)一步發(fā)展，監(jiān)控的培養(yǎng)參數(shù)越來越詳細(xì)，對細(xì)菌代謝過程的了解和掌握也越來越透徹，更有利于研究和控制其培養(yǎng)過程。但仍然還有許多不足和不夠完善的地方，對大腸桿菌的生長代謝理論也還有待更深入詳細(xì)地研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Riesenberg D.High-cell-density cultivation ofE.coli[J].Curr Op-in Biotechnol，1991，2(3)：380-384.

[2] van de Walle M，Shiloach J.Proposed mechanism of acetate accumulation in two recombinantEscherichiacolistrains during high density fermentation[J].Biotechnol Bioeng，1998，57(1):71-78.

[3] 胡爽，蔡海波，蔣加慶，等.重組大腸桿菌HT02高密度高表達(dá)HT-1融合蛋白發(fā)酵過程優(yōu)化[J].化工學(xué)報，2009，60(12)：3063-3070.

[4] Bunch A W.High cell density growth of microorganisms[J].Biotechnol Genet Eng Rev，1994，12(5)：536-561.

[5] 李民，陳常慶，樸勤，等.利用恒溶氧—補料分批技術(shù)高密度培養(yǎng)大腸桿菌生產(chǎn)重組人骨形成蛋白-2A[J].生物工程學(xué)報，1998，14(3)：270-275.

[6] Korz D L，Rinas U，Hellmuth K，et al.Simple fed-batch technique for high cell density cultivation ofEscherichiacoli[J].J Biotechnol，1995，39(1)：59-65.

[7] Medaglia G，Valsesia G，Panke S.Development of a high cell-density protocol for the production of pregallidermin，a non-toxic precursor of the lantibiotic gallidermin[J].J Biotechnol，2010，145(2):176-185.

[8] Lau J，Tran C，Licari P，et al.Development of a high cell-density fed-batch bioprocess for the heterologous production of 6-deoxyerythronolide B inEscherichiacoli[ J].J Biotechnol，2004，110(1)：95-103.

[9] 朱才慶，葉勤.微量元素對大腸桿菌生長和乙酸生成的影響研究[J].微生物學(xué)報，2004，44(2)：230-234.

[10] Lee S Y.High cell-density culture ofEscherichiacoli[J].Tr-ends Biotechnol，1996，14(3)：98-105.

[11] Ohta K，Shibui T，Morimoto Y，et al.High level production of human proapo A-I by fed-batch culture of recombinantEscherichiacoli[J].J Ferment Bioeng，1993，75(2)：155-157.

[12] 程立坤，黃靜，秦永鋒，等.代謝副產(chǎn)物乙酸對L-色氨酸發(fā)酵的影響[J].微生物學(xué)通報，2010，37(2):166-173.

[13] Castan A，Nasman A，Enfors S-O.Oxygen enriched air supply inEscherichiacoliprocesses：Production of biomass and recombinant human growth hormone[J].Enzyme Microb Technol，2002，30(7):847-854.

[14] 汪嶸，趙穎怡，張云開，等.高密度培養(yǎng)基因工程菌的條件優(yōu)化[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2002，21(1)：58-61.

[15] 涂桂云，李敏.基因工程菌高密度發(fā)酵工藝研究進(jìn)展[J].工業(yè)微生物，2004，34(3):49-52.

[16] Wolfe A J.The acetate switch[J].Microbiol Mol Biol Rev，2005，69(1)：12-50.

[17] Han K，Lim H C，Hong J.Acetic acid formation inEscherichiacolifermentation[J].Biotechnol Bioeng，1992，39(6)：663-671.

[18] Oh M K，Rohlin L，Kao K C，et al.Global expression profiling of acetate-grownEscherichiacoli[J].J Biol Chem，2002，277(15):13175-13183.

[19] Shiloach J，F(xiàn)ass R.GrowingE.colito high cell density——A historical perspective on method development[J].Biotechnol Adv，2005，23(5):345-357.

[20] Son Y J，Bae J Y，Chong S H，et al.Expression，high cell density culture and purification of recombinant EC-SOD inEscherichiacoli[J].Appl Biochem Biotechnol，2010，162(6):1585-1598.

[21] 孫艷，王長城，張玲，等.重組大腸桿菌產(chǎn)膽固醇氧化酶的指數(shù)流加策略[J].化工進(jìn)展，2010，29(1)：130-133.

[22] Jeong K J，Rani M.High-level production of a single chain antibody against anthrax toxin inEscherichiacoliby high cell density cultivation[J].Bioprocess Biosyst Eng，2011，34(7):811-817.

[23] Kim S G，Shin S Y，Park Y C，et al.Production and solid-phase refolding of human glucagon-like peptide-1 using recombinantEscherichiacoli[J].Protein Expr Purif，2011，78(2):197-203.

[24] Restaino O F，Cimini D，De Rosa M，et al.High cell density cultivation ofEscherichiacoliK4 in a microfiltration bioreactor：A step towards improvement of chondroitin precursor production[J].Microb Cell Fact，2011，10(1):1-10.

[25] Biener R，Steinkamper A，Hofmann J.Calorimetric control for high cell density cultivation of a recombinantEscherichiacolistrain[J].J Biotechnol，2010，146(1-2):45-53.

[26] 須文波，潘豐，馮斌.智能控制在發(fā)酵過程中的應(yīng)用[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2000，19(5)：455-457.

[27] Fukuda T，Shibata T.Theory and applications of neural networks for industrial control systems[J].IEEE，T Ind Electron，1992，39(6)：472-489.

[28] Duan S B,Shi Z P，F(xiàn)eng H J，et al.An on-line adaptive control based on DO/pH measurements and ANN pattern recognition model for fed-batch cultivation[J].Biochem Eng J，2006，30(1):88-96.

[29] Contiero J，Beatty C，Kumari S，et al.Effects of mutations in acetate metabolism on high-cell-density growth ofEscherichiacoli[J].J Ind Microb Biotechnol，2000，24(6):421-430.

[30] Soto R，Caspeta L，Barron B，et al.High cell-density cultivation in batch mode for plasmid DNA production by a metabolically engineeredE.colistrain with minimized overflow metabolism[J].Biochem Eng J，2011，56(3):165-171.

[31] Knabben I，Regestein L，Marquering F，et al.High cell-density processes in batch mode of a genetically engineeredEscherichiacolistrain with minimized overflow metabolism using a pressurized bioreactor[J].J Biotechnol，2010，150(1)：73-79.