腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6在高血壓心肌肥厚大鼠實驗中的意義

史 君 王 靜 王 星 孫艷宏 范曉梅 納仁高娃

1.內蒙古醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生理教研室，內蒙古 呼和浩特 010059；2.內蒙古醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，內蒙古 呼和浩特 010051

心肌肥厚主要是由于心臟在長期壓力負荷過重的情況下，肥大的心肌需氧量增加，而冠狀動脈的供血量往往不能予以滿足，造成心肌缺血從而引起心肌重構，其發(fā)生的結構基礎主要是心肌細胞增大和纖維化。它還是心力衰竭的早期重要病理過程，也是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率升高的獨立危險因素[1]。近年來隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)心肌肥厚的逆轉可以降低心血管疾病的危險性[2]，且炎癥因子在心肌肥厚的形成中具有重要作用[3]，因此，心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制顯得尤為重要，但迄今各種炎癥因子在心肌肥厚發(fā)病機制中的確切作用尚不完全清楚。本實驗就細胞因子中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）在高血壓心肌肥厚大鼠血清和心肌中的表達變化進行研究，探討TNF-α和IL-6在心肌肥厚中所表達的作用，為今后的研究及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 心肌肥厚模型的制備

內蒙古大學實驗動物研究中心提供的Wistar大鼠180～220g 20只，均用標準顆粒性飼料喂養(yǎng)。按照預期實驗要求喂養(yǎng)1周后隨機分為兩組，即心肌肥厚組和假手術組，每組10只。參照Anderson方法制作壓力負荷性心肌肥厚大鼠模型[4]。假手術組中，利用手術分離大鼠一小段腹主動脈后，穿過一消毒手術縫線，但不作結扎，內臟恢復原位后關閉腹腔，繼續(xù)飼養(yǎng)。各組大鼠術后按要求飼養(yǎng)8周，以戊巴比妥鈉麻醉后稱重，斷頭取血，摘取心臟。測取左心室重計算心室重與體重比值（LVW/BW）作為心肌肥厚指數(shù)。

1.2 動脈收縮壓（SBP）的測定

分別取各組大鼠，將其放入Power Lab系統(tǒng)配備的大鼠固定器內，露出鼠尾，將尾根部放在烤燈下加熱5～10 min，使鼠尾動脈充分擴張后，將其穿過加壓尾套并固定于鼠尾根部，使大鼠尾部腹面正中與Power lab ML125／R（澳大利亞埃德儀器有限公司生產）無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)的脈搏傳感器緊密接觸，然后觀測系統(tǒng)的脈搏波形，當出現(xiàn)穩(wěn)定的脈搏波時即可開始測定血壓。動物安靜后給尾套充氣加壓，可見脈搏波逐漸減小至消失，然后尾套開始放氣，鼠套壓力降低，當壓力等于收縮壓時，開始出現(xiàn)脈搏波，此點的血壓值即動脈收縮壓。重復測量3次，取平均值，以kPa表示。

1.3 血清TNF-α、IL-6水平的測定

術后飼養(yǎng)8周處死大鼠，采取斷頭取血法，抽取4 mL血樣，然后離心分離血清，-20℃保存。測定前先置室溫復融，混勻后，利用4℃ 3000 r/min離心5 min，取上清液，嚴格按試劑盒說明書進行（分析試劑盒由北京東雅生物技術研究所提供）加樣操作。

1.4 RT-PCR法擴增大鼠TNF-α及IL-6基因

1.4.1 引物設計和合成 具體引物由上海申友生物公司合成，包括：β-actin上游引物 5-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′；β-actin 下游引物 5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′；TNF-α 上游引物 5′-TGT TGT AGC AAA CCC TCA AG-3′；TNF-α 下游引物 5′-AAG TAG ACC TGC CCA GAC T-3′；IL-6 上游引物 5′-CAC TCA CCT CTT CAG AAC GA-3′；IL-6 下游引物 5-TGG CAT TTG CAT TTG TGG TTG GGT-3′，以上使用前均稀釋成 10 μmol/L。

1.4.2 實驗操作步驟 取30 mg心肌組織，采用TRIZOL一步法提取組織總RNA，應用RT-PCR法檢測大鼠心肌組織中IL-6及TNF-α基因的表達水平。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司，按照說明書進行加樣操作。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP計算機圖像掃描分析系統(tǒng)測定電泳條帶密度值，以β-actin為內參照，計算TNF-α mRNA及IL-6 mRNA的相對含量，結果以TNF-α、IL-6條帶占β-actin條帶密度的百分率（%）表示。

1.5 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，經半定量處理后的實驗結果以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用配對t檢驗，確立檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心肌肥厚大鼠收縮壓和心指數(shù)的變化

與假手術組比較，心肌肥厚組術后8周動脈收縮壓升高（P ＜ 0.05），心指數(shù)明顯增加（P ＜ 0.05）。 見表 1。

表1 心肌肥厚組和假手術組SBP、LVW/BW的變化（，n=10）

表1 心肌肥厚組和假手術組SBP、LVW/BW的變化（，n=10）

注：與假手術組比較，*P<0.05

組別 例數(shù) SBP（kPa） LVW/BW（mg/g）心肌肥厚組假手術組101026.4±0.3*15.7±0.53.0±0.4*2.4±0.2

2.2 心肌肥厚大鼠血清中TNF-α、IL-6含量變化

腹主動脈部分結扎手術后8周，血清TNF-α、IL-6含量增加，與假手術組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 心肌肥厚組和假手術組TNF-α、IL-6血清含量的變化（，n=10）

表2 心肌肥厚組和假手術組TNF-α、IL-6血清含量的變化（，n=10）

注：與假手術組比較，*P<0.05

組別 例數(shù) TNF-α（μg/L） IL-6（ng/L）心肌肥厚組假手術組10103.5±0.8*1.9±0.4443.1±176.2*174.3±30.2

2.3 心肌肥厚大鼠心肌TNF-α、IL-6 mRNA表達的變化

PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，以反應條帶在圖像分析系統(tǒng)內行吸光度掃描進行半定量分析，IL-6 mRNA及TNF-α mRNA的相對含量用兩者條帶積分的灰度值與其相應的β-actin的灰度值之比表示。與假手術組比較，心肌肥厚組心肌的 IL-6 mRNA及 TNF-α mRNA表達增加 （P＜0.05）。 見表 3。

表3 RT-PCR檢測兩組心肌IL-6及TNF-α mRNA結果（，n=10）

表3 RT-PCR檢測兩組心肌IL-6及TNF-α mRNA結果（，n=10）

注：與假手術組比較，*P<0.05

組別 例數(shù) IL-6 mRNA TNF-α mRNA心肌肥厚組假手術組10100.51±0.05*0.22±0.030.69±0.05*0.21±0.02

3 討論

3.1 成功構建心肌肥厚大鼠模型

心肌肥厚是指心肌細胞體積增大和心肌纖維增生[5]，是心臟對機械牽張和神經體液刺激的一種主要反應[6]。心肌肥大起初是一種對負荷增加或損傷的代償，但持續(xù)性心肌肥大則最終會因心功能失常而導致心力衰竭，因此探討其機制非常重要。本實驗參照Anderson方法制作壓力負荷性心肌肥厚大鼠模型，選取造模8周時進行數(shù)據(jù)研究。據(jù)文獻報道[7-9]，造模4周時心肌肥厚模型已經建成，造模8周時模型比較穩(wěn)定。筆者在前期的實驗中分別通過造模4周和8周觀察到心肌肥厚組心肌細胞彌漫性肥大，畸形、核大、深染，心肌纖維走行紊亂，間質增生。本實驗結果顯示心肌肥厚組SBP和LVW/BW顯著升高，說明成功制備心肌肥厚大鼠模型。

3.2 心肌肥厚大鼠血清和心肌中TNF-α、IL-6的水平變化及意義

TNF-α是炎性細胞因子之一，其具有多種效應，目前認為TNF-α可以誘導心肌肥厚[10]。TNF-α對心肌的作用復雜多樣，可致心肌細胞凋亡[11]，也可引起心肌細胞肥大[12]。TNF對膠原纖維的生成和降解進行雙向調節(jié)[13-15]。據(jù)報道[10-11]在體外培養(yǎng)的乳鼠和成年貓科動物的心肌細胞中，TNF-α可誘導心肌肥大。王桂君等[16]研究結果顯示100 μg/L TNF-α能夠誘導心肌肥大，表現(xiàn)為蛋白合成、蛋白含量以及細胞體積增大，并增加心肌細胞內Ca2+濃度。IL-6也是一種炎性細胞因子，可致心肌細胞肥大，還有抗凋亡的作用。體外實驗中IL-6可直接引起心肌成纖維細胞膠原合成的增加。Flesh等[17]在機械張力刺激的實驗中觀察到中等程度的拉長心肌細胞時IL-6輕微增加，20 min后TNF-α無變化，60 min后IL-6也不再變化，而在心肌細胞嚴重拉長時則導致TNF-α、IL-6逐漸增加至較高水平，同時TNF-α、IL-6受體表達也增多。轉基因小鼠出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，條件是在心臟同時過表達IL-6和IL-6受體。綜上所述，炎癥因子TNF-α、IL-6參與心肌肥厚過程，但這些研究多集中于離體心臟或培養(yǎng)的心肌細胞層面，而炎癥細胞因子在疾病過程中對心臟肥大的實際效應以及在體外實驗和整體動物中的參與程度和方式會有不同。本實驗從整體水平出發(fā)，參照Anderson方法制作壓力負荷性心肌肥厚大鼠模型，選取TNF-α、IL-6兩種炎癥細胞因子，觀察它們在心肌肥厚大鼠血清和心肌中的表達變化。結果顯示，與假手術組比較，心肌肥厚組大鼠血清TNF-α、IL-6含量增加（P<0.05）；肥厚心肌中TNF-α、IL-6 mRNA表達增加（P<0.05）。提示TNF-α、IL-6參與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展，其機制可能是：縮窄大鼠腹主動脈致心肌后負荷增加，從而使心臟做功增加，耗氧增多，代謝產物堆積，同時心臟神經體液等因素的激活使核因子-κB（NF-κB）、活化蛋白-1（AP-1）、信號轉導活化轉錄因子（STAT）活化[18]，可產生一些細胞因子及無菌性炎癥，其中包括TNF-α及IL-6的增加。而TNF-α及IL-6在心肌細胞上的異常表達，可刺激各種生長因子[19-20]的表達，這些生長因子作用于心肌細胞，促使其肥大[21]。實驗中還觀察到血清和心肌中TNF-α、IL-6水平均升高，變化一致，可能是壓力負荷增加導致心肌中TNF-α、IL-6 mRNA轉錄及蛋白質合成增加，使得進入血液循環(huán)的TNF-α、IL-6增多，進一步刺激心肌肥厚產生。因此，從本實驗的觀測結果可以得知：炎性細胞因子TNF-α、IL-6參與心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展過程。

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