蚤休薯蕷皂苷對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用涉及TLR4/NF-κB途徑

高琳琳，李福榮，姚樹桐，桑 慧，司艷紅，焦 鵬，秦樹存

(泰山醫(yī)學(xué)院1.病理生理學(xué)教研室，2.藥物化學(xué)教研室，3.動脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000)

動脈粥樣硬化(atherosderosis，AS)是一種復(fù)雜的多因素疾病，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS形成的早期病變，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥機(jī)制在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著極為重要的作用［1］。最近研究表明，非感染性甚至感染性因素引起的炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)的活化貫穿于AS的始終［2］。

近年研究表明介導(dǎo)先天免疫和炎癥反應(yīng)的受體Toll樣受體4(TLR4)參與了 AS的發(fā)生和發(fā)展。TLR4與特異性自身配體結(jié)合后，通過髓樣分化因子88(MyD88)依賴性或非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活下游一系列蛋白級聯(lián)反應(yīng)，將刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、活化蛋白-1、干擾素調(diào)節(jié)因子等重要免疫基因轉(zhuǎn)錄因子的活化，最終激發(fā)一系列針對不同病原微生物的免疫事件［3］，而TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AS發(fā)生和發(fā)展中的機(jī)制尚不明確。

本課題組前期實驗中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)抗蛇毒藥物蚤休能夠減輕高脂血癥大鼠動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放內(nèi)皮素以及抗H2O2誘導(dǎo)的凋亡［4－6］，具有減輕動脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和抑制主動脈中膜平滑肌增殖的功效，從而具有防治AS和高血壓病的作用。為了進(jìn)一步探討蚤休對內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)機(jī)制，深入研究中醫(yī)藥對TLR4及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)特性及其調(diào)控機(jī)制的影響，從細(xì)胞和分子水平開展前瞻性的實驗研究，本實驗應(yīng)用流式細(xì)胞儀PI染色、激光共聚焦顯微鏡JC-1染色及Western blot檢測ox-LDL損傷前后對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期、線粒體電位、TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討蚤休成分對細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的機(jī)制及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1 材料與試劑

1.1 材料 蚤休薯蕷皂苷(Rhizome Dioscin，RD)由天津馬克生物技術(shù)有限公司提供，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)與JC-1熒光染料購自南京凱基生物公司，兔抗人TLR4、NF-κB多克隆抗體購自武漢博士德公司，二抗羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司，PI染液、JC-1染色試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 ox-LDL的制備和鑒定［7］采用序列超速離心法分離健康人新鮮血漿低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，經(jīng)瓊脂糖電泳、十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳均顯示為單一蛋白條帶。提純的LDL用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS液透析48 h，隨后在含 10 μmol·L－1CuSO4的 PBS 液(pH 7.2)中37℃溫育透析12 h，最后在含100 μmol·L－1EDTA的 PBS中4℃透析24 h。過濾除菌，BCA試劑定量蛋白，用 PBS調(diào)蛋白濃度至1 g·L－1，4℃保存?zhèn)溆?。取氧化前后?LDL，測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)丙二醛(malondialdehyde，MDA)的濃度，并采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定ox-LDL的形成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，以含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，按每瓶2 ml接種于25 ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每48 h更換培養(yǎng)液1次。待細(xì)胞融合率為70% ～80%時，無血清培養(yǎng)12 h后使細(xì)胞同步化于G0期，然后按分組分別加藥進(jìn)行預(yù)處理24 h。細(xì)胞分組如下:正常對照組:不加任何藥物的培養(yǎng)基;氧化損傷組:ox-LDL終濃度為100 mg·L－1;RD高、中、低劑量預(yù)處理組:(1 mg·L－1、100 μg·L－1、10 μg·L－1)，加藥預(yù)處理后加入ox-LDL，作用12 h。

2 方法

2.1 流式細(xì)胞儀PI染色分析各實驗組細(xì)胞周期變化 37℃溫箱取出各處理組細(xì)胞培養(yǎng)瓶，胰蛋白酶消化，分別收集細(xì)胞放入試管中。將試管以1 000 r·min－1離心 5 min，棄上清液，加入 4℃ PBS，渦旋方式混勻，再離心，洗滌細(xì)胞2次。將4℃ 70%的乙醇約0.5 ml貼壁緩慢加入試管中，固定細(xì)胞。以1 800 r·min－1離心細(xì)胞懸浮液5 min，傾去固定液。再加PBS離心洗滌細(xì)胞1次。每毫升106細(xì)胞加入500 U的RNA酶，使終濃度為50 mg·L－1，37℃保溫30 min。離心去除RNA酶，再經(jīng)PBS洗1次，去上清液。每106細(xì)胞加50 mg·L－1的 PI 1 ml，室溫下避光染色20 min以后，300目尼龍網(wǎng)過濾。上流式細(xì)胞儀測定(激發(fā)波長488 nm，氫離子激光)，用multcycleDNA分析軟件包進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

2.2 JC-1染色檢測線粒體膜電位 蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞于6孔板，藥物處理結(jié)束，PBS洗滌，加入500 μl JC-1工作液，培養(yǎng)箱中孵育15～20 min，孵育液洗滌，取出蓋玻片于熒光顯微鏡下觀察拍照。當(dāng)膜電位水平較高時，JC-1主要以聚合體形式存在，呈紅色熒光，當(dāng)膜電位水平較低時，主要以單體形式存在，呈綠色熒光。通過Image ProPlus圖像分析軟件測定細(xì)胞內(nèi)的紅色和綠色熒光強(qiáng)度，相對定量線粒體膜電位水平。

2.3 Western blot法檢測蛋白的表達(dá) 細(xì)胞接種于25 mm培養(yǎng)瓶內(nèi)，在各處理因素作用后，預(yù)冷的PBS洗2次，加入 65 μl細(xì)胞裂解液，4℃靜置30 min，1 200 r·min－1離心 10 min，取上清，BCA 法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后加入1∶1 000稀釋的兔抗人的抗體，輕搖過夜，用TBST洗3次，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次，ECL顯色后，用Image軟件進(jìn)行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 實驗各組藥物對細(xì)胞周期的影響 各實驗組DNA倍體分析圖可見，損傷組G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于對照組、S期細(xì)胞百分比低于對照組(P＜0.01)，而RD各濃度組預(yù)處理后，G0/G1期細(xì)胞比例低于對照組、S期細(xì)胞百分比明顯高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)，見流式細(xì)胞儀PI染色DNA倍體分析結(jié)果(Fig 1、2)。

Fig 1 Effect of RD on cell cycle of HUVEC observed by flow cytometry A:Normal control;B:injured group;C:10 μg·L－1RD;D:100 μg· L－1 RD;E:1 mg·L－1RD

3.2 激光共聚焦顯微鏡JC-1染色檢測細(xì)胞線粒體跨膜電位(ΔΨm)的變化 與正常對照組相比，ox-LDL損傷組紅色熒光強(qiáng)度減弱而呈現(xiàn)較為鮮亮的綠色，顯示線粒體對JC-1攝取量下降，表明ox-LDL引起線粒體跨膜電位降低，導(dǎo)致電位去極化的發(fā)生。RD預(yù)處理24 h的HUVEC，同陰性對照組相比膜電位升高，細(xì)胞著色逐漸向紅色過渡，見Fig 3。

3.3 實驗各組TLR4和NF-κB表達(dá)的變化 結(jié)果表明，經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)，TLR4和NF-κB的表達(dá)增多，而RD各組均可抑制TLR4和NF-κB的表達(dá) 其中RD低劑量組與ox-LDL損傷組各指標(biāo)相差不明顯，RD中高劑量組較損傷組則有明顯差異，見Fig 4、5。

Fig 2 Ratio of cell cycle distribution of RD of HUVEC observed by flow cytometry

Fig 3 Effect of RD on mitochondrial membrane potential(ΔΨm)of HUVEC observed by laser scanning confocal microscope

4 討論

蚤休為百合科多年生草本植物蚤休及其同屬植物的根莖，藥用歷史悠久，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，是著名的中成藥“云南白藥”的成分之一。常用于治療癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、驚風(fēng)抽搐等。蚤休化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括有甾體、脂肪酸酯、黃酮類及多糖。蚤休主要有效成分是甾體皂苷，文獻(xiàn)報道及本課題組前期實驗均證實皂苷有較強(qiáng)的抗氧化和抗炎癥損傷的藥理活性。

Fig 4 Effect of RD on TLR4 expression in protein level of HUVEC by Western blot

Fig 5 Effect of RD on NF-κB expression in protein level of HUVEC by Western blot

目前動脈粥樣硬化(AS)被認(rèn)為是一種在發(fā)病起始和整個過程中都伴有免疫反應(yīng)的慢性炎癥性疾病過程，大量流行病學(xué)臨床病理學(xué)和動物模型的研究均提示，TLR4在AS的發(fā)生、發(fā)展中起著重大作用。TLR4通過激活天然免疫，參與特異性免疫應(yīng)答的啟動，促進(jìn)炎癥的發(fā)展，在AS中發(fā)揮了重要作用。同時在AS發(fā)展過程中血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)發(fā)生增殖、遷移，并分泌細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白酶等，促進(jìn) AS的發(fā)生、發(fā)展。此外，TLR4與VSMC之間存在一定的相互作用，對AS的不同階段產(chǎn)生影響。

研究發(fā)現(xiàn) ，與正常血管相比，AS病變中的TLR4表達(dá)明顯增加。體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下TLR4表達(dá)很低，但經(jīng)促炎因子刺激，TLR4表達(dá)明顯升高［8］。此外，在早期AS病變中血管平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，在此過程中血管中層平滑肌細(xì)胞中TLR4表達(dá)上調(diào)。而ox-LDL等TLR4內(nèi)源性配體與TLR4結(jié)合后，致使TLR4的表達(dá)增加以及 TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活［9］。Edfeldt等［10］在AS的斑塊中發(fā)現(xiàn)TLR4的表達(dá)明顯提高，并證實正是通過 TLR4的識別功能導(dǎo)致一系列與AS有關(guān)的細(xì)胞因子的合成與釋放TLR4激活所生成的炎癥因子 IL-6、IL-1和TNF-α等能刺激血管平滑肌細(xì)胞的遷移及增殖。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)ΔΨm的理想熒光探針?？梢詸z測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光。線粒體電位去極化導(dǎo)致熒光染料的攝入量下降是大多數(shù)細(xì)胞凋亡的早期事件，其發(fā)生意味著線粒體功能發(fā)生損傷［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組細(xì)胞著色為亮紅色不同，ox-LDL可導(dǎo)致HUVEC的線粒體膜電位下降，細(xì)胞呈現(xiàn)鮮亮的綠色，而RD處理后，隨著藥物濃度增加逐漸向紅色過渡，因此RD能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的ΔΨm下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL氧化損傷的HUVEC的TLR4的表達(dá)明顯增加，且這種增加可能與其血漿中ox-LDL等修飾脂蛋白增加有關(guān)，實驗結(jié)果表明，RD作用后，HUVEC的氧化凋亡下降，細(xì)胞周期阻滯解除，線粒體膜電位恢復(fù)，表現(xiàn)為S期細(xì)胞比率增加，JC-1染色顯示線粒體膜電位呈濃度依賴性明顯升高，且TLR4及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的NF-κB表達(dá)明顯減弱，這提示RD具有抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC發(fā)生凋亡的作用，其機(jī)制可能部分與TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活、穩(wěn)定線粒體膜電位、保護(hù)線粒體功能、從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在AS發(fā)生當(dāng)中有著重要作用，該信號途徑的激活至少是 AS發(fā)生當(dāng)中的一個重要環(huán)節(jié)［10］，通過對 TLR4及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在AS發(fā)生、發(fā)展中所起作用的認(rèn)識，有助于人們找到治療AS性疾病新的治療策略。因此，開發(fā)靶點特異、高效的TLR4拮抗藥物，可望為AS的中醫(yī)藥治療及其機(jī)制研究提供新的切入點。結(jié)合本實驗研究結(jié)果提示，RD是一種具有多方位內(nèi)皮保護(hù)效應(yīng)的藥物，在抑制 TLR4/NF-κB途徑的激活，阻斷內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷、細(xì)胞周期阻滯，繼而阻斷AS的發(fā)生發(fā)展，尤其是預(yù)防上具有潛在的應(yīng)用價值。至于RD對蛋白表達(dá)調(diào)控具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］ Ross R.Atherosclerosis-An inflammation disease［J］.N Engl J Med，1999，340(2):115 －23.

［2］ Doyle S L，O’Neill L A.Toll-like receptors:from the discovery of NFkappaB to new insights into transcriptional regulations in innate immunity［J］.Biochem Pharmacol，2006，72(7):1102 －13.

［3］ Youn H S，Lee J Y，Saitoh S I，et al.Suppression of MyD88 and TRIF-dependent signaling pathways of Toll-like receptor by(－)-epigallocatechin-3-gallate，a polyphenol component of green tea［J］.Biochem Pharmacol，2006，72(7):850 －9.

［4］ 杜艷芝，閆曉梅，胡維誠，等.清熱解毒液對高脂血癥大鼠內(nèi)皮素影響的研究［J］.中國病理生理雜志，1999，15(12):1134－7.

［4］ Du Y Z，Yan X M，Hu W C，et al.The effect of heat-clearing and detoxifying fluid on endothelin in hyperlipidemic rats［J］.Chin J Pathophysiol，1999，15(12):1134 －7.

［5］ 高琳琳，李福榮，康 莉，等.蚤休醇提物對 H2O2損傷的ECV304細(xì)胞的細(xì)胞周期與凋亡的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24(11):1513 －8.

［5］ Gao L L，Li F R，Kang L，Wang H.Effects of bistortae ethanol extraction on cell cycle and apoptosis of ECV304 injured by hydrogen peroxide［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(11):1513 －8.

［6］ 高琳琳，李福榮，康 莉，王 浩.蚤休皂苷對過氧化損傷導(dǎo)致的ECV304細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29(3):274 －7.

［6］ Gao L L，Li F R，Kang L，Wang H.Effects of Pariphyllin on injury induced by hydrogen peroxide on apoptosis in ECV304［J］.Chin J Gerontol，2009，29(3):274 －7.

［7］ Cominacini L，Garbin U，Davoli A，et al.A simple test for predisposition to LDL oxidation based on the fluorescence development during copper-catalyzed oxidative modification［J］.J Lipid Res，1991，32(2):349 －58.

［8］ Wu J，Zhou J，Chen X，et al.Attenuation of LPS-induced inflammation by ICT，a derivate of icariin，via inhibition of the CD14/TLR4 signaling pathway in human monocytes［J］.Int Immunopharmacol，2012，12(1):4 －9.

［9］ Guerrero A T，Cunha T M，Verri WA Jr，et al.Toll-like receptor 2/MyD88 signaling mediates zymosan-induced joint hypernociception in mice:participation of TNF-α，IL-1β and CXCL1/KC［J］.Eur J Pharmacol，2012，674(1):51 －7.

［10］ Edfeldt K，Bennet A M，Eriksson P，et al.Association of hyporesponsive toll-like receptor 4 variants with risk of myocardial infarction［J］.Eur Heart J，2004，25(16):1447 － 53.

［11］侯金才，張 鵬，劉建勛，等.梔子苷對缺氧/復(fù)氧小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4通路的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27(6):769 －73.

［11］ Hou J C，Zhang P，Liu J X，et al.Geniposide on TLR4 pathway in cultured rat microglia with hypoxia/reoxygenation［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(6):769 －73.