鐵皮石斛多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

蔡海蘭，黃曉君，聶少平，田 芳，謝明勇，崔武衛(wèi)，3

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047;2.云南金九地生物科技有限公司，云南昆明650033;3.加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部圭爾夫食品研究中心，安大略爾夫NIG5C9)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo.)是蘭科石斛屬多年生草本植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有“主傷中;除痹，下氣;補(bǔ)五臟虛勞羸瘦，強(qiáng)陰。久服厚腸胃;輕身延年”的作用。以新鮮或干燥莖入藥，云南、貴州、浙江、安徽、江西、湖南等地均有分布。古語(yǔ)有云:“北有人參，南有楓斗”，鐵皮石斛由于其獨(dú)特的藥用價(jià)值，2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》中作為單獨(dú)一味中藥從近百種石斛屬植物中突顯出來(lái)，建立起自己明確的專屬性標(biāo)準(zhǔn)。鐵皮石斛化學(xué)成分多樣，主要有生物堿、多糖、菲類、聯(lián)芐類、香豆素類、花青素等化合物［1－2］，關(guān)于鐵皮石斛多糖的研究，國(guó)內(nèi)外主要集中在多糖的提取方法和結(jié)構(gòu)解析上［3－4］，對(duì)鐵皮石斛多糖的藥理研究較少，已有部分報(bào)道證明鐵皮石斛多糖具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)［5－7］等作用。本文將以小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，研究鐵皮石斛多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性、腫瘤壞死因子TNF-α的分泌、TNF-α mRNA的表達(dá)及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的影響［8］，旨在闡述鐵皮石斛多糖免疫調(diào)節(jié)作用的可能機(jī)制，為充分開(kāi)發(fā)應(yīng)用鐵皮石斛提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購(gòu)自上海細(xì)胞所，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中(含 100 mg·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素)，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每天換液，隔2 d傳代1次。

1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，脂多糖(LPS)(美國(guó)Sigma公司)，TNF-α ELISA 試劑盒(武漢博士德公司)，TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermenta公司)，PCR試劑盒(北京全式金公司)，細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(南京凱基公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京碧云天公司)，β-actin小鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(北京中杉公司)，I-κB兔多單克隆抗體(美國(guó)CST公司)。

1.3 鐵皮石斛多糖 來(lái)源為云南鐵皮石斛干燥莖(云南金九地生物科技有限公司提供)，經(jīng)水提醇沉后得到粗多糖(polysaccharides from Dendrobium officinale，DOP)。經(jīng)硫酸苯酚法檢測(cè)其糖含量為75%，凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量為9% 。DOP溶于一定量細(xì)胞培養(yǎng)液中，過(guò)濾除菌，－20℃分裝保存。

1.4 儀器與設(shè)備 3K15-高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(深圳國(guó)華電器有限公司)，METTLER TOLEDO AL104電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司)，CO2培養(yǎng)箱、E-330酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(吳江市凈化設(shè)備總廠)，倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)，PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 采用MTT法檢測(cè)DOP對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以5×104/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入不同體積的鐵皮石斛多糖，補(bǔ)充培養(yǎng)液至200 μl，使多糖終濃度為20，40，80，160 mg·L－1;同時(shí)設(shè)LPS組(終濃度為1 mg·L－1)。在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入20 μl MTT，上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩器上震蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。

2.2 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌TNF-α 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞1×105/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)處理同“2.1”項(xiàng)，24 h后取上清液測(cè)定TNF-α含量。每實(shí)驗(yàn)組6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。采用ELISA試劑盒，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，450 nm處測(cè)定吸光度。

2.3 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)TNF-α mRNA調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/孔接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)處理同“2.1”項(xiàng)，培養(yǎng) 24 h，TRIzol試劑盒提取RAW264.7細(xì)胞RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。TNF-α引物上游序列:5'-CTTCAGCCCCAG CAGTGTATTCTTT-3'，下游序列:5'AGAGAACCTGGGAGTAGACAAGGTA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為 692 bp;β-actin上游序列:5'-CACCACACCTTCTACAATGAGCTGC-3'，下游序列:5'-GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為153 bp。PCR條件為 94℃ ×30 s，60 ℃ ×30 s，72 ℃ ×2 min，29 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，Quantity One軟件分析。

2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中I-κBα蛋白表達(dá)收集空白組、DOP 處理組(80，160 mg·L－1)、LPS組(1 mg·L－1)細(xì)胞，按胞質(zhì)蛋白提取試劑盒要求提取蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。加入SDS-蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸5 min變性，－80℃保存。在10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進(jìn)行電泳，每孔蛋白上樣量30 μg。50 V電泳30 min，至指示劑到濃縮膠與分離膠交界處，改為100 V電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部，停止電泳。置硝酸纖維膜，放入電轉(zhuǎn)槽中進(jìn)行電轉(zhuǎn)移(60 V，120 min)。移膜至含封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床搖動(dòng)封閉1 h。加一抗孵育4℃過(guò)夜。洗滌后加二抗，室溫孵育1 h后，再次洗滌。用ECL檢測(cè)液發(fā)光顯影定影，Quantity One軟件分析。

3 結(jié)果

3.1 DOP對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活性影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Tab 1)顯示，DOP可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，且在 20、40、80 mg·L－1劑量范圍內(nèi)與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，高劑量(160 mg·L－1)的DOP細(xì)胞增殖率下降，但仍可促進(jìn)細(xì)胞增殖，表明DOP無(wú)細(xì)胞毒作用。

Tab 1 Effects of DOP on cell proliferation in RAW264.7 cells by MTT assay(±s，n=6)

Tab 1 Effects of DOP on cell proliferation in RAW264.7 cells by MTT assay(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal control

Group Dose/mg·L－1Proliferation rate/%Normal control 0 0.00 ±0.004 Positive control(LPS)1 18.90 ±0.089＊＊DOP 10 10.17 ±0.101 20 18.29 ±0.173＊＊40 15.10 ±0.134＊＊80 14.28 ±0.146＊＊160 8.94 ±0.141

3.2 DOP對(duì) RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果(Tab 2)顯示，DOP能刺激小鼠巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子TNF-α，并隨著DOP劑量的增加，TNF-α的分泌量逐漸升高，與空白組相比，20、40、80、160 mg·L－1處理組差異均具有顯著性。

Tab 2 Effects of DOP on TNF-α production in RAW264.7 cells(±s，n=6)

Tab 2 Effects of DOP on TNF-α production in RAW264.7 cells(±s，n=6)

*P＜0.05;＊＊P＜0.01 vs normal control

Group Dose/mg·L －1 TNF-α/ng·L －1 Normal control 25.64 ±0.003 Positive control(LPS)1 84.00 ±0.015＊＊DOP 20 31.25 ±0.032*40 33.63 ±0.075＊＊80 36.46 ±0.013＊＊160 47.72 ±0.06＊＊

3.3 DOP對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)的影響 在“3.2”中發(fā)現(xiàn)DOP可以劑量依賴性增加小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌量，但是不清楚這種分泌量的增加是否在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，故對(duì)TNF-α mRNA進(jìn)行半定量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如Fig 1所示。在未受刺激的狀態(tài)下，TNF-α mRNA少量表達(dá)，LPS處理后，TNF-α mRNA表達(dá)量明顯增加。DOP處理組隨著DOP濃度的增加，TNF-α mRNA的表達(dá)量也呈增加趨勢(shì)，160 mg·L－1劑量下達(dá)到最大值。說(shuō)明DOP促進(jìn)TNF-α的分泌可能是通過(guò)增加TNF-α mRNA表達(dá)量來(lái)調(diào)控。

Fig 1 Effects of DOP on the expression of mRNA of TNF-α

3.4 DOP對(duì)RAW264.7細(xì)胞I-κBα蛋白表達(dá)的影響 在“3.2”、“3.3”研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以80、160 mg·L－1為 DOP 的作用濃度。DOP 作用于RAW264.7細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取蛋白，Western blot檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi) I-κBα水平，結(jié)果如Fig 2所示。DOP作用于RAW264.7細(xì)胞后，樣品內(nèi)參β-actin蛋白量表達(dá)基本不變的情況下，DOP能劑量依賴性降低RAW264.7細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)I-κBα 水平。

Fig 2 I-κB expression by DOP-stimulated RAW264.7 cells

4 討論

巨噬細(xì)胞是免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有多種免疫功能，包括免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)等，在機(jī)體的先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［9］。TNF-α是活化的巨噬細(xì)胞殺滅病原微生物及腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，可通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞MHCⅡ類分子，提高其抗原遞呈能力;還可提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)超氧陰離子產(chǎn)生，增強(qiáng)ADCC(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用)功能，刺激細(xì)胞脫顆粒和分泌髓過(guò)氧化物酶;活化NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用。由于巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α在抗腫瘤，提高免疫力等方面有獨(dú)特的作用，已激起人們極大的興趣去發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)TNF-α 的免疫治療劑［10－11］。研究表明 NF-κB 的特異性性抑制劑PDTC(Pyrrolidine Dithiocarbamate)可以抑制 TNF-α 的表達(dá)［12］，說(shuō)明 NF-κB 參與 TNF-α轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。在靜止細(xì)胞中，NF-κB抑制蛋白(I-κB)與 NF-κB p65 蛋白結(jié)合，覆蓋 p50 核定位信號(hào)，使NF-κB以一種非活化的形式存在于胞質(zhì)中。巨噬細(xì)胞激活后可促使I-κBα磷酸化降解，從而使NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，隨著 NF-κB的激活，一系列在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的炎癥因子、趨化因子的基因表達(dá)也相應(yīng)被激活，如IL-1β、IL-6、NO 等，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白 D、E［13］。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)DOP作用于細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，在所用劑量范圍內(nèi)，MTT測(cè)定證實(shí)其無(wú)細(xì)胞毒性。通過(guò)檢測(cè) DOP作用后 RAW264.7的TNF-α分泌增加，證實(shí)了DOP具有促TNF-α分泌的作用。與此同時(shí)，DOP增加TNF-α mRNA表達(dá)和I-κBα蛋白表達(dá)。研究結(jié)果提示，DOP增加TNF-α的分泌可能歸結(jié)于兩個(gè)原因:(1)DOP直接在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TNF-α mRNA的表達(dá);(2)DOP通過(guò)抑制I-κBα 的表達(dá)，破壞了 I-κBα-NF-κB 復(fù)合物導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，從而調(diào)控TNF-α mRNA的表達(dá)。因此，DOP誘導(dǎo)的TNF-α的明顯分泌可說(shuō)明其具有增強(qiáng)免疫的功能。在臨床上，可作為癌癥治療的免疫輔助藥物來(lái)緩解抗癌藥物的副作用，這也解釋了為何鐵皮石斛自古以來(lái)以其獨(dú)特的藥用價(jià)值被人們奉為九大仙草之首，其中發(fā)揮免疫增強(qiáng)活性的有效成分可能是DOP。但是，由于多糖分子量較大，可能主要通過(guò)細(xì)胞表面多糖特異性受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［15］，因而關(guān)于DOP發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的具體作用機(jī)制如信號(hào)通路等仍需要進(jìn)一步研究。

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