氯化兩面針堿對(duì)人肝癌裸鼠移植瘤基因表達(dá)譜的影響

劉麗敏，劉華鋼

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021)

氯化兩面針堿(nitidine chloride，NC)是從廣西特有藥用植物兩面針［Zanthoxylum nitidum(Roxb)DC］的根中分離到的具有抗腫瘤活性的生物堿，本課題組前期的研究結(jié)果表明NC能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，給藥劑量為10 mg·kg－1時(shí)NC對(duì)人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤的抑瘤率為60.91%，與環(huán)磷酰胺療效相近［1－2］，具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性。為了進(jìn)一步揭示其抗腫瘤機(jī)制，我們利用基因芯片研究了NC治療肝癌后一些相關(guān)基因表達(dá)的改變，了解NC在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的影響，以期篩選NC的相關(guān)作用靶點(diǎn)，更全面探討NC針對(duì)肝癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 NC由廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員分離提純(純度＞95%)，Human OneArray表達(dá)譜芯片由上海康成生物工程有限公司提供(Phalanx array);TRIzol試劑、Super ScriptryⅡRNase逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP:美國(guó)Invitrogen;cDNA標(biāo)記試劑盒、NucAway柱:Ambion公司;單熒光標(biāo)記CyDye:Amersham;EB:Sigma公司;DEPC:Amresco公司;瓊脂糖:加拿大BBI公司;RNA later:華氏生物技術(shù)有限公司;氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇:廣州新港公司;cDNA合成試劑盒、SYBR Green qPCR Kit:TaKaRa;PCR擴(kuò)增引物為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 基因芯片檢測(cè)

1.2.1 標(biāo)本處理 基因芯片分析所用的腫瘤組織樣品為本課題組前期建立的肝癌HepG2裸小鼠移植瘤模型［1］，NC 2.5、5 和 10 mg·kg－1劑量對(duì)肝癌HepG2的抑制率分別為 12.06%、35.63%和60.91%［1］。生理鹽水組和NC高劑量組各取瘤塊，生理鹽水沖洗。切至厚度在0.5 cm以下，長(zhǎng)約1 cm，放入裝有5倍體積RNA later的凍存管中。4℃孵育過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)入－20℃中保存待用。

1.2.2 總RNA樣品制備及雙鏈cDNA合成 TRIzol法抽提肝癌組織標(biāo)本總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA質(zhì)量、樣品濃度及總量，獲得的RNA溶液保存于－80℃。以純化后的RNA為模板，根據(jù)cDNA合成試劑盒的操作手冊(cè)合成cDNA的第1鏈和第2鏈。

1.2.3 aRNA合成、純化及標(biāo)記 按照試劑盒說(shuō)明操作，標(biāo)記好的aRNA被收集在1.5 ml離心管中。未標(biāo)記的染料留在柱子中。去掉柱子，測(cè)OD值，確定標(biāo)記效率。使用NanoDrop ND-1000測(cè)定標(biāo)記后aRNA的濃度以及純度，其中OD260/280值應(yīng)該在1.8～2.1之間。標(biāo)記上CyDye的aRNA的濃度比上總的aRNA的濃度即為aRNA標(biāo)記效率，標(biāo)記效率＞9，標(biāo)記效率合格。

1.2.4 芯片雜交及檢測(cè) 雜交好的芯片干燥后經(jīng)GenePix 4000B掃描儀掃描，軟件Imagequant 5.0將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強(qiáng)度的數(shù)字信號(hào)顯示。將圖像導(dǎo)入圖像分析軟件OneArray GenePix Array List，自動(dòng)尋點(diǎn)，手工微調(diào)。掃描儀自動(dòng)開始分析，以陰性對(duì)照點(diǎn)雜交信號(hào)為參照，大于陰性對(duì)照點(diǎn)平均信號(hào)強(qiáng)度加上3倍的陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)偏差［＞Average(blank)+3SD(blank)］的雜交信號(hào)作為有效雜交信號(hào)。數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，Ratio值通過(guò)LOWESS方法歸一化，表示每個(gè)基因點(diǎn)的雜交信號(hào)強(qiáng)度比值，或者是基因表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間的變化倍數(shù)(大于1代表相應(yīng)基因表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)，小于1代表相應(yīng)基因表達(dá)量下調(diào)，其倍數(shù)用1除以該數(shù)值表示)。判斷標(biāo)準(zhǔn)Ratio大于1.5或小于0.67作為有效表達(dá)變化的基因數(shù)據(jù)。將分析結(jié)果導(dǎo)入Excel表，進(jìn)行下一步分析，包括數(shù)據(jù)的預(yù)處理和歸一化、差異表達(dá)基因分析、芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、聚類分析等。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)對(duì)部分差異基因(3個(gè)下調(diào)基因、1個(gè)上調(diào)基因)的表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證。

1.2.5.1 總RNA樣品制備及雙鏈cDNA合成 同“1.2.2”。生理鹽水組和NC高劑量組各取6個(gè)樣本。

1.2.5.2 引物的設(shè)計(jì)和合成 參照文獻(xiàn)并從Gene Bank查找 TOP1、TOP2、IL-8、RTEL 及內(nèi)參 GAPDH基因的全序列，再根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物由TaKaRa公司合成。引物序列如Tab 1所示。

Tab 1 Real-time PCR primer sequence

1.2.5.3 Real-time PCR擴(kuò)增及結(jié)果計(jì)算 建立一個(gè)25 μl的反應(yīng)體系，2 ×SYBR Premix Ex TagTM12.5 μl，上下游引物各 0.5 μl，cDNA 溶液 2 μl，ddH2O 4.5 μl，優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，再 95℃ 變性 10 s，59℃ 退火 15 s，72℃ 延伸(收集熒光)20 s。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到95℃(每0.5℃讀板一次)。各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由儀器生成。每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)改變的總體分析 數(shù)據(jù)分析顯示:在所檢測(cè)的30 968個(gè)基因中，NC處理組與生理鹽水組比較，發(fā)現(xiàn)有差異表達(dá)基因共有369個(gè)，其中上調(diào)基因183個(gè)，下調(diào)基因186個(gè)。我們?cè)趯?duì)這些表達(dá)差異基因進(jìn)行分類時(shí)發(fā)現(xiàn)許多基因具有多種功能，參與多種細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程，涉及到細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子受體和核受體、細(xì)胞凋亡、分化、細(xì)胞周期/周期素、蛋白降解、DNA損傷/修復(fù)、離子通道、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞粘連等多個(gè)方面。差異基因影響的信號(hào)通路主要有泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞核受體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子及其受體信號(hào)通路、IL-3信號(hào)通路、細(xì)胞周期信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等。

2.2 部分表達(dá)差異的基因 我們從差異表達(dá)基因最多的細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控、細(xì)胞周期、腫瘤免疫相關(guān)等幾個(gè)方面篩選出部分基因，并對(duì)其功能進(jìn)行簡(jiǎn)單分析。由于篇幅所限，本文中僅列出部分與凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因，見Tab 2。

2.3 Real time PCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)基因的表達(dá)水平 采用GAPDH內(nèi)參校正后樣品相對(duì)含量見Fig 3，其中3個(gè)基因的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，一個(gè)基因的表達(dá)水平高于對(duì)照組，表達(dá)的改變與芯片研究結(jié)果具有一致性。

3 討論

肝癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其表達(dá)譜與正常肝細(xì)胞相比有很大差別，其中表達(dá)增加的基因數(shù)目少于表達(dá)降低的基因數(shù)目，推測(cè)與癌細(xì)胞的功能簡(jiǎn)單化有關(guān)，核糖體相關(guān)蛋白表達(dá)的降低也證明這一點(diǎn)［3－4］。我們?cè)趯?duì)NC作用后的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析時(shí)發(fā)現(xiàn)有許多基因具有多種功能，參與多種細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程，涉及到細(xì)胞凋亡或腫瘤相關(guān)、結(jié)合蛋白相關(guān)及信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、翻譯等多個(gè)方面。結(jié)合基因表達(dá)狀態(tài)與功能分析，發(fā)現(xiàn)以下一些較為明顯的現(xiàn)象。

NC作用后Bcl-2家族的Bcl-w基因表達(dá)下調(diào)，Bcl-w這個(gè)基因在人和鼠是高度保守的，類似Bcl-2和Bcl-x，Bcl-w參與調(diào)控許多種細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，也是一個(gè)原癌基因［5］。研究者使用免疫組織化學(xué)法分析61例肺腺癌病例，顯示Bcl-w過(guò)表達(dá)與腫瘤分期、分化程度相關(guān)，并傾向于伴隨預(yù)后不良。用小分子RNA干擾技術(shù)下調(diào)Bcl-w表達(dá)明顯地抑制HUT29細(xì)胞的生長(zhǎng)，但對(duì)抗癌藥物引起的細(xì)胞死亡無(wú)效。Bcl-w的過(guò)表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌尤其是肺腺癌的生長(zhǎng)，可能是一個(gè)治療的靶點(diǎn)［6］。Bcl-w還是肝特異性的小分子RNA(miRNA)——miR-122的直接作用靶點(diǎn)，對(duì)肝細(xì)胞癌株Hep3B和HepG2，miR-122通過(guò)直接的靶向結(jié)合Bcl-w的3'-UTR區(qū)，調(diào)節(jié)Bcl-w的表達(dá)，使胞內(nèi)的 Bcl-wmRNA和蛋白水平被抑制，并引起細(xì)胞存活率下降和caspase-3激活［7］。Bcl-2蛋白家族調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與線粒體密切相關(guān)。Bcl-2和Bcl-X1抑制細(xì)胞凋亡的部分原因是阻斷了細(xì)胞色素C(Cyto C)從線粒體釋放，Cyto C是凋亡蛋白酶激活的關(guān)鍵因素。Bcl-2可以直接或間接阻止Cyto C釋放，但不是唯一功能［8］。目前Bcl-w抑制細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制是否也與線粒體有關(guān)尚未清楚。NC抑制Bcl-w基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，可能有利于提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。

Tab 2 Differentially expressed genes in HepG2 cells after treatment of NC

Tab 3 Relative amount of mRNA in tumor organization treated by NC(±s，n=6)

Tab 3 Relative amount of mRNA in tumor organization treated by NC(±s，n=6)

group RTEL1/GAPDH TopoⅠ/GAPDH TopoⅡ/GAPDH IL-8/GAPDH Control 1.68E-01 2.36E-01 1.56E-01 6.60E-03 NC 1.02E-01 7.31E-02 1.30E-01 1.08E-02

其他與細(xì)胞凋亡調(diào)控和功能相關(guān)基因(如IHPK2、AMID、RTEL1)也有不同程度的變化，其中上調(diào)的基因IHPK2(inositol hexaphosphate kinase 2)即六磷酸肌醇酯激酶2，又名PiUS;IP6K2，該基因編碼的蛋白屬于肌醇磷酸激酶(IPK)家族，1998年被克隆出來(lái)，定位于人染色體的3p 21.3，認(rèn)為它可能是細(xì)胞磷(體內(nèi))平衡的重要調(diào)節(jié)器［9］。Morrison等［10］為了研究干擾素IFN-β誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，采用反義技術(shù)敲除基因來(lái)辨別引起細(xì)胞死亡的基因產(chǎn)物，并分離了幾個(gè)干擾素-誘導(dǎo)死亡的調(diào)節(jié)子(RIDs)，其中一個(gè)是IP6K2，并鑒定了IP6K2是一個(gè)凋亡的正調(diào)節(jié)蛋白，IP6K2的過(guò)表達(dá)強(qiáng)化了 IFN-β和細(xì)胞毒劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。IP6K2的表達(dá)致敏腫瘤細(xì)胞，未受照射的NIH-OVCAR-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染了IP6K2后形成克隆減少。IP6K2的過(guò)表達(dá)引起放射敏感性增加，表現(xiàn)為集落生成單位(CFU)減少。IFN-β和輻射都能誘生caspase-8，在IP6K2表達(dá)的細(xì)胞，Caspase-8 mRNA的誘導(dǎo)更明顯，資料顯示IP6K2的過(guò)表達(dá)強(qiáng)化了卵巢癌對(duì)放射和IFN-β的敏感性，IP6K2可能有利于增強(qiáng)細(xì)胞受損后caspase-8和死亡受體DR4的表達(dá)和(或)功能，IFN-β和γ輻照誘導(dǎo)凋亡，通過(guò)外部的、受體介導(dǎo)的的途徑，這兩個(gè)死亡誘導(dǎo)物都受 IP6K2的正調(diào)節(jié)［11］。此后Morrison等又進(jìn)一步研究了IHPK2生長(zhǎng)抑制和增強(qiáng)凋亡的機(jī)制，證實(shí)了IHPK2與TNF受體-伴隨的因子(TRAF)2結(jié)合及干擾了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-活性激酶1(TAK1)的磷酸化，藉此抑制NF-κB信號(hào)。IHPK2包含2個(gè)與TRAF2結(jié)合的必需位點(diǎn):Ser-347和Ser-359。與野生型IHPK2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，表達(dá)S347A和S359A突變的細(xì)胞在IFN-α作用后顯示出3到5倍的TAK1激活作用，這個(gè)突變體在IFN-α作用后，與野生型 IHPK2-表達(dá)的細(xì)胞相比，在NF-κBDNA結(jié)合方面表現(xiàn)出6到10倍的增強(qiáng)，而野生型IHPK2-表達(dá)的細(xì)胞NF-κB的DNA結(jié)合是被抑制的［12］。研究者認(rèn)為IHPK2-TRAF 2結(jié)合引起TAK1和NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)的衰減，可能是IHPK2細(xì)胞凋亡活性的部分原因。NC作用后IHPK2表達(dá)上調(diào)，有利于增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。

在以前的研究中我們已證實(shí)，NC可能作用于細(xì)胞的G2/M調(diào)控點(diǎn)，表現(xiàn)出G2/M期阻滯作用，從而影響細(xì)胞的分裂增殖。NC可能會(huì)通過(guò)作用于G2/M期調(diào)控因子cyclinB1和cdc2，影響其mRNA水平及其蛋白表達(dá)［13］?；蛐酒慕Y(jié)果發(fā)現(xiàn)NC作用后HepG2細(xì)胞的PR48、MTSS1基因表達(dá)上調(diào)，cyclin T2基因表達(dá)下調(diào)，其可能主要在細(xì)胞周期調(diào)控和DNA修復(fù)起作用。cyclin T2屬于高度保守的細(xì)胞周期素家族(cyclin family)，主要參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。cyclin T2與周期素依賴激酶9(CDK9)結(jié)合形成 CDK9/cyclin T2復(fù)合物［14］，這個(gè)復(fù)合物是人類基因轉(zhuǎn)錄延伸因子P-TEFb的亞單位，它能磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)最大亞基的羧基端結(jié)構(gòu)域，激活PolⅡ的轉(zhuǎn)錄功能，抑制CDK9/cyclin T2的激酶活性，對(duì)PolⅡ催化的基因轉(zhuǎn)錄起負(fù)調(diào)控作用，其中包括HIV-1tat啟動(dòng)子控制的基因轉(zhuǎn)錄反應(yīng)［15-16］及基因轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)功能，后者是指DNA修復(fù)效率與基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)有關(guān)，處于轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)的基因的DNA損傷修復(fù)比沉默基因的修復(fù)效率要高，基因轉(zhuǎn)錄鏈的修復(fù)效率比非轉(zhuǎn)錄鏈的要高，這種修復(fù)反應(yīng)是由有關(guān)DNA修復(fù)蛋白和某些轉(zhuǎn)錄因子共同完成。當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，如果DNA損傷得到修復(fù)后細(xì)胞周期進(jìn)程重新繼續(xù)。另一種修復(fù)損傷細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制就是通過(guò)凋亡過(guò)程消滅它們。cyclin T2基因表達(dá)的下調(diào)，說(shuō)明NC可能通過(guò)抑制cyclin T2介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)錄、偶聯(lián)修復(fù)功能，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。

MTSS1基因又名MIM(Missing in metastasis)，是控制細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，對(duì)細(xì)胞周期的發(fā)展起負(fù)調(diào)控作用。MTSS1的過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，其表達(dá)受其啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)CpG島DNA甲基化的調(diào)節(jié)，但MTSS1的表達(dá)水平與p53的功能狀態(tài)無(wú)關(guān)［17－19］。Ma 等［20］研究了 MTSS1 在肝臟腫瘤發(fā)展中的作用，發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌臨床患者中，MTSS1的基因和蛋白表達(dá)水平上升。它的表達(dá)明顯與早期病理學(xué)國(guó)際惡性腫瘤標(biāo)記符號(hào)階段分組、腫瘤包裹、缺乏靜脈浸潤(rùn)相關(guān)。發(fā)現(xiàn)更高的MTSS1表達(dá)與疾病的早期階段相關(guān)，MTSS1的表達(dá)可能影響肝細(xì)胞癌的發(fā)展并可能是疾病早期階段的一個(gè)有力標(biāo)志。

除此之外，NC作用后與分裂/增殖相關(guān)的基因MIG6、TBCE表達(dá)明顯上調(diào)，而另一類與生長(zhǎng)因子相關(guān)的基因如GRB7、CDH2、LAMA1等表達(dá)下調(diào)，提示NC可能通過(guò)某些機(jī)制抑制有絲分裂從而影響腫瘤細(xì)胞增殖。腫瘤免疫相關(guān)的基因CCL5、IL-8上調(diào)，IL-15、IFNE1、COX4I1下調(diào)。此類誘生的細(xì)胞因子可能通過(guò)誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)LAKC和腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)，并刺激他們產(chǎn)生細(xì)胞因子，發(fā)揮廣譜的腫瘤殺傷活性。腫瘤免疫相關(guān)的基因可能在NC對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，NC作用于肝癌的基因調(diào)控是一個(gè)多基因、多環(huán)節(jié)、多途徑參與的過(guò)程。上述基因的改變?yōu)殛U明NC誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞G2/M期周期阻滯的機(jī)制提供了很好的理論依據(jù)。但由于基因芯片上的基因是已知，而很多基因的功能目前尚未研究清楚，還受到基因表達(dá)與調(diào)控滯后的影響，如何解釋這些基因同時(shí)變化還有相當(dāng)大的難度;并且基因表達(dá)不能完全代表其產(chǎn)物的功能，基因表達(dá)的結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)和酶，才能實(shí)現(xiàn)其各項(xiàng)生理功能，而基因與蛋白質(zhì)功能并非完全平行。因此基因芯片的檢測(cè)只是第一步，只是提供了進(jìn)行藥物作用機(jī)制全面分析的一個(gè)初步信息，對(duì)于已經(jīng)初步獲得的差異基因，需做進(jìn)一步分析驗(yàn)證，還需要與其他檢測(cè)蛋白質(zhì)和酶的實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合，以充分發(fā)揮基因芯片高通量的優(yōu)勢(shì)。

［1］ 劉麗敏，劉華鋼.氯化兩面針堿的抗肝癌活性及對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響［J］，中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(4):497 －500.

［1］ Liu L M，Liu H G.Anti-hepatoma activity of Nitidine Chloride and its effect on topoisomerase［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):497－500.

［2］ 劉麗敏，劉華鋼，羅 丹，等.氯化兩面針堿體內(nèi)和體外的抗腫瘤作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2009，23(3):214 －8.

［2］ Liu L M，Liu H G，Luo D.Antitumor effect of nitidine chloride in vitro and in vivo［J］.Chin J Pharm acol Toxicol，2009，23(3):214－8.

［3］ 宮衛(wèi)東，陽(yáng) 威，李亞洲，等.原發(fā)性肝癌患者外周血中肝癌相關(guān)基因基因芯片篩查［J］.西南國(guó)防醫(yī)藥，2010，20(4):362－4.

［3］ Gong W D，Yang W，Li Y Z，et al.Screening hepatoma assoc iated genes in peripheral blood in patients with primary hepaticcarcinoma by gene chips［J］.Med J Nat Defend Forces Southwest China，2010，20(4):362－4.

［4］ 簡(jiǎn)志祥，鄭江華，孫 建，等.利用基因芯片技術(shù)篩選肝癌早期復(fù)發(fā)相關(guān)基因［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(24):4461 －5.

［4］ Jian Z X，Zheng J H，Sun J，et al.Identification of differentiated expression genes associated with early recurrence for hepatocellular carcinoma using genechip technology［J］ J Pract Med，2010，26(24):4461－5.

［5］ Navarro S J，Trinh T，Lucas C A，et al.The C57BL/6J mouse strain background modifies the effect of a mutation in Bcl2/2［J］.G3(Bethesda)，2012，2(1):99－102.

［6］ Kawasaki T，Yokoi S，Tsuda H，et al.BCL2L2 is a probable target for novel 14q11.2 amplification detectedin a non-small cell lung cancer cell line［J］.Cancer Sci，2007，98(7):1070 － 7.

［7］ Lin C J，Gong H Y，Tseng H C，et al.miR-122 targets an antiapoptotic gene，Bcl-w，in human hepatocellular carcinoma cell lines［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008 ，375(3):315 －20.

［8］ Bae I H，Yoon S H，Lee S B，et al.Signaling components involved in Bcl-w induced migration of gastric cancer cells［J］.Cancer Lett，2009，277(1):22 －8.

［9］ David S，Shames，John D，et al.IP6K2 is a client for HSP90 and a target for cancer therapeutics development［J］.PNAS，2008，105:1389－90.

［10］ Morrison B H，Bauer J A，Kalvakolanu D V，et al.Inositol hexakisphosphate kinase 2 mediates growth suppressive and apoptotic effects of interferon-beta in ovarian carcinoma cells［J］.J Biol Chem.2001，276(27):24965－70.

［11］ Morrison B H，Bauer J A，Hu J，et al.Inositol hexakisphosphate kinase 2 sensitizes ovarian carcinoma cells to multiple cancer therapeutics［J］.Oncogene，2002，21(12):1882 － 9.

［12］ Morrison B H，Bauer J A，Lupica J A，et al.Effect of inositol hexakisphosphate kinase 2 on transforming growth factor beta-activated kinase 1 and NF-kappaB activation.［J］.J Biol Chem，2007，282(21):15349－56.

［13］ 李丹妮，劉華鋼，劉麗敏，等.氯化兩面針堿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的研究［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，30(1):40 －3.

［13］ Li D N，Liu H G ，Liu L M，et al.Nitidine chloride-induced apoptosis of human hepatoma cell SMMC-7721［J］.J Xi an Jiaotong Univ(Med Sci)，2009，30(1):40－3.

［14］Kurosu T，Zhang F，Peterlin B M.Transcriptional activity and substrate recognition of cyclin T2 from P-TEFb［J］.Gene，2004，343(1):173－9.

［15］ Michels A A，F(xiàn)raldi A，Li Q，et al.Binding of the 7SK snRNA turns the HEXIM1 protein into a P-TEFb(CDK9/cyclin T)inhibitor［J］.EMBO J，2004，23(13):2608 －19.

［16］ Parent M，Yung T M，Rancourt A，et al.Poly(ADP-ribose)polymerase-1 is a negative regulator of HIV-1 transcription through competitive binding to TAR RNA with Tat.Positive transcription elongation factor b(p-TEFb)complex［J］.J Biol Chem，2005，280(1):448－57.

［17］ Saarikangas J，Mattila P K，Varjosalo M，et al.Missing-in-metastasis MIM/MTSS1 promotes actin assembly at intercellular junctions and is required for integrity of kidney epithelia ［J］.J Cell Sci，2011，124:1245 －55.

［18］ Du P，Ye L，Ruge F，et al.Metastasis suppressor-1，MTSS1，acts as a putative tumour suppressor in human bladder cancer［J］.Anticancer Res，2011;31:3205 －12.

［19］ Liu W，Komiya Y，Mezzacappa C，et al.MIM regulates vertebrate neural tube closure［J］.Development，2011，138:2035 －47.

［20］ Ma S，Guan X Y，Lee T K，et al.Clinicopathological significance of missing in metastasis B expression in hepatocellular carcinoma［J］.Hum Pathol，2007，38(8):1201 －6.