白藜蘆醇對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)誘發(fā)癲癇樣放電的影響

尤竹燕，王斌生，解 敏，李 珍，王烈成

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽合肥 230032;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058)

癲癇是由多種原因引起的局部腦區(qū)神經(jīng)元群異常放電所致的行為和功能異常的發(fā)作性慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是臨床上最常見(jiàn)的癲癇類(lèi)型，但由于目前對(duì)其機(jī)制還不是很明確，因此給它的治療帶來(lái)很大困難。癲癇的藥物防治目前研究進(jìn)展緩慢，使用經(jīng)典的抗癲癇藥物如苯妥英鈉、丙戊酸等可有效地控制部分癲癇發(fā)作，但仍有20%～25%癲癇患者經(jīng)正規(guī)抗癲癇藥物治療后難以控制，發(fā)展成為慢性或難治性癲癇。另外，由于目前經(jīng)典的抗癲癇藥物在藥動(dòng)學(xué)和藥理學(xué)上均有缺陷，因此臨床上一直在找尋新型的抗癲癇藥物。白藜蘆醇(Res)是多種植物在遭受損傷、紫外線照射和真菌感染時(shí)合成的一種抗菌素［1］，具有多酚結(jié)構(gòu)，并具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗誘變、抗衰老和降血脂等方面的作用。目前認(rèn)為，Res對(duì)神經(jīng)元有一定的營(yíng)養(yǎng)、損傷修復(fù)和保護(hù)作用［2］，近年來(lái)，Res對(duì)癲癇的治療也逐漸引起了關(guān)注［3］。本研究采用離體腦片場(chǎng)電位記錄技術(shù)，通過(guò)在灌流腦脊液中加入不同濃度的Res，觀察并分析Res對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)癲癇樣活動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量200～240 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑 KA、bicuculline、Res均購(gòu)自 Sigma公司，水合氯醛、戊巴比妥鈉購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器 SN-2腦立體定位儀(日本 Narishige);Strong 90顱骨鉆 (韓國(guó) Saeshin公司);NVSLM1振動(dòng)切片機(jī)(美國(guó)WPI);P-97微電極拉制儀(美國(guó)Sutter);Model 3000 AC/DC差分放大器(美國(guó)A-M systems);Master-8生物電刺激器(以色列A.M.P.I.);powerlab 8/30 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(澳大利亞ADInstruments)。

1.2 方法

1.2.1 TLE動(dòng)物模型建立 大鼠經(jīng)水合氯醛(350 mg·kg－1)腹腔麻醉后，固定于立體定位儀上，暴露顱骨，按大鼠立體定位圖譜［4］確定右側(cè)海馬CA3區(qū)注射靶點(diǎn)(AP:－4.0 mm，ML:4.4 mm，DV:3.8 mm)，用微量注射針注入 2.5 ～3 μl KA(0.4 g·L－1)，注射15 min，留針 10 min，術(shù)后縫合頭皮。大鼠急性發(fā)作等級(jí)參照Racine標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)［5］，達(dá)到Ⅳ級(jí)及以上視為建模成功，模型大鼠在手術(shù)后2～4周進(jìn)行細(xì)胞外場(chǎng)電位記錄。

1.2.2 離體腦片制備 大鼠用2%戊巴比妥鈉麻醉后迅速斷頭取腦，置于持續(xù)給予95%O2和5%CO2混合氣的4℃人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中。待腦組織冷卻后按水平切面切成400 μm厚的腦片，并將其移至含(30 ±2)℃ ACSF的孵育槽中，持續(xù)通入混合氣，孵育1～2 h。ACSF成分 (mmol· L－1)包 括:NaCl 124，KCl 4.5，NaH2PO41.6，MgCl22.1，CaCl22.7，NaHCO326，Glucose 10，pH調(diào)定在7.4左右。

1.2.3 場(chǎng)電位記錄 將孵育的腦片移至記錄槽，持續(xù)灌流95%O2和5%CO2混合氣飽和的ACSF，灌流速度2 ml·min－1，溫度32℃。刺激電極為雙極鎢絲電極，通過(guò)高倍顯微鏡及定位儀的輔助操作，將其置于輻射層Schaffer側(cè)支通路;記錄電極為內(nèi)充2 mol·L－1NaCl的玻璃微電極，阻抗5～8 MΩ，置于CA1區(qū)錐體細(xì)胞層記錄群峰電位(population spike，PS)。刺激頻率0.033 Hz，波寬0.1 ms。由記錄電極引導(dǎo)的誘發(fā)電位經(jīng)微電極放大器放大，輸入powerlab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)進(jìn)行觀察、記錄和分析。藥物實(shí)驗(yàn)通過(guò)腦片灌流給藥途徑，給藥前穩(wěn)定記錄誘發(fā)電位30 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間均數(shù)用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)正常大鼠海馬CA1區(qū)PS的影響電刺激離體海馬腦片Schaffer側(cè)支，在CA1區(qū)錐體細(xì)胞層通常可記錄到單個(gè)PS，見(jiàn)Fig 1A;在灌流正常腦片的ACSF中分別加入低、中和高劑量(分別為 5、15、50 μmol·L－1)的 Res，當(dāng)含有相應(yīng)濃度的Res持續(xù)灌流腦片20 min后記錄的PS分別為灌流前的(98.32±1.3)%、(97.29±2.9)%、(96.46±1.5)%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析PS幅度均無(wú)明顯變化(n=8，P ＞0.05)。見(jiàn) Fig 1B，F(xiàn)ig 1C 及 Fig 1D。

2.2 Bicuculline及KA誘發(fā)大鼠海馬CA1區(qū)癇樣放電活動(dòng)的PS 用GABAA受體拮抗劑bicuculline(30 μmol·L－1)灌流正常海馬腦片 20 min 后可引起4～6個(gè)PS的癇樣放電活動(dòng)，見(jiàn)Fig 2A;KA造模成功后所致的大鼠海馬腦片也可記錄到4～6個(gè)PS的癇樣放電活動(dòng)，見(jiàn)Fig 2B。

2.3 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)bicuculline所致大鼠海馬CA1區(qū)癲癇樣活動(dòng)PS的影響

2.3.1 低、中劑量 Res對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)誘發(fā)癲癇樣活動(dòng)PS的影響 在正常海馬腦片灌流bicuculline 20 min的基礎(chǔ)上，再灌流低劑量的Res(5 μmol·L－1)20 min后，前4個(gè)PS幅度均無(wú)明顯變化，分別為灌流前的(99.61±3.1)%、(102.66±3.2)%、(98.91±3.2)%、(99.65±3.3)%(n=8，P ＞0.05;Fig 3A)。用中劑量的 Res(15 μmol·L－1)灌流海馬腦片20min后，前4個(gè)PS幅度也無(wú)明顯變化，分別為灌流前的(98.27±2.9)%、(97.60±4.8)%、(97.08±5.4)%、(100.40±4.6)%(n=8，P ＞0.05;見(jiàn) Fig 3B)。提示腦片灌流 5 ～15 μmol·L－1的Res對(duì)bicuculline所致的CA1區(qū)癲癇樣放電活動(dòng)沒(méi)有明顯的影響。

Fig 1 Effects of resveratrol on PS in rat hippocampal CA1 region(The arrow marks the stimulus artifact of PS)

Fig 2 PS of epileptiform discharges evoked by bicuculline(A)and KA(B)in rat hippocampal CA1 region

2.3.2 高劑量的Res對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)誘發(fā)癲癇樣活動(dòng)PS的影響 在正常海馬腦片灌流bicuculline 20 min的基礎(chǔ)上，再灌流高劑量的Res(50 μmol·L－1)20 min后，前4個(gè)PS幅度均出現(xiàn)明顯性降低，分別為灌流前的(70.13±5.4)%、(67.87±3.6)%、(63.09±3.5)%、(61.01±5.3)%(n=8，P＜0.01;Fig 3C);并且PS數(shù)目也明顯減少，為灌流前的(82.02±1.3)%(n=8，P ＜0.01;Fig 3D)。以上結(jié)果表明 50 μmol·L－1的 Res對(duì) bicuculline 所致的CA1區(qū)癲癇樣放電活動(dòng)有部分抑制作用。

2.4 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)PS的影響 在顳葉癲癇模型大鼠海馬腦片上，用低劑量的Res(5 μmol·L－1)灌流海馬腦片20 min后，前4個(gè)PS幅度均無(wú)明顯變化，分別為灌流前的(98.61±3.3)%、(96.55±4.9)%、(95.22±2.5)%、(98.49±3.1)%(n=6，P ＞0.05;Fig 4A);用中劑量的 Res(15 μmol·L－1)灌流海馬腦片20 min后，前4個(gè)PS幅度也無(wú)明顯變化，分別為灌流前的(100.52±1.3)%、(101.30±2.7)%、(102.68±3.1)%、(103.36 ±3.2)%(n=6，P ＞0.05，F(xiàn)ig 4B)。而用高劑量的 Res(50 μmol·L－1)灌流海馬腦片20 min后，前4個(gè)PS幅度均明顯降低，分別為灌流前的(84.39±5.4)%、(84.40±4.9)%、(83.88±4.8)%、(81.30±6.3)%(n=6，P ＜0.01;Fig 4C);PS數(shù)目也明顯減少，為灌流前的(84.58±2.4)%(n=6，P ＜ 0.01;Fig 4D)。提示 50 μmol·L－1的Res對(duì)癲癇大鼠海馬CA1區(qū)場(chǎng)電位異常放電有部分抑制作用。

3 討論

癲癇是由多種病因引起的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，各種癲癇發(fā)作的本質(zhì)都是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些細(xì)胞群發(fā)生突然地、過(guò)度地、同步地異常放電所引起的行為異常，異常放電的確切機(jī)制至今尚未完全闡明。目前較一致的觀點(diǎn)是癲癇發(fā)病是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)興奮性與抑制性不平衡所致。近年來(lái)的研究表明，這種興奮與抑制間的不平衡主要與突觸傳遞［6］、氧化應(yīng)激［1］及受體介導(dǎo)［7］等的改變有關(guān)。

Bicuculline是大鼠海馬GABAA受體的拮抗劑，GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性遞質(zhì)，其離子型GABAA受體的激活可增加神經(jīng)元細(xì)胞膜的Cl－通透性，產(chǎn)生抑制性突觸后電位，發(fā)揮抑制效應(yīng)［8］。通過(guò)海馬腦片灌流bicuculline可以使這種抑制作用減弱，并記錄到多個(gè)PS的癇樣放電活動(dòng)(見(jiàn)Fig 2)。KA是從海人草中提取的一種外源性氨基酸，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似于谷氨酸，是興奮性氨基酸 KA受體的特異性激動(dòng)劑，具有很強(qiáng)的興奮作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在大鼠海馬內(nèi)微量注射KA對(duì)海馬產(chǎn)生興奮毒性，從而誘發(fā)癲癇，且此種模型與人類(lèi)癲癇的病理變化和行為表現(xiàn)很相似［9－10］，通過(guò)腦片灌流的方式也可記錄到多個(gè)PS的癇樣放電活動(dòng)(見(jiàn)Fig 2)。

Fig 3 Effects of resveratrol with low，middle and high dose on PS evoked by bicuculline in rat hippocampal CA1 region

本研究通過(guò)離體腦片的場(chǎng)電位記錄發(fā)現(xiàn)隨著白藜蘆醇灌流濃度增加到50 μmol·L－1對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)誘發(fā)的癲癇樣電活動(dòng)有部分抑制作用，Res不但能降低大鼠海馬Bicuculline誘發(fā)的癲癇樣電活動(dòng)，且能降低注射KA的造成大鼠癲癇模型的海馬CA1區(qū)的癲癇樣電活動(dòng)，提示一定濃度的白藜蘆醇對(duì)癲癇的異常放電有一定的抑制效應(yīng)，這與我們以往在整體癲癇大鼠模型所觀察的結(jié)果一致［10］。Bicuculline和KA均可使大鼠海馬興奮性與抑制性神經(jīng)元上受體表達(dá)失衡，興奮性神經(jīng)元過(guò)度興奮，抑制性神經(jīng)元大量死亡，從而使海馬處于過(guò)興奮狀態(tài)導(dǎo)致癲癇樣場(chǎng)電位出現(xiàn)多個(gè)群峰電位(PS)。Res能有效對(duì)抗KA誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬CA1、CA3和齒狀回(DG)門(mén)區(qū)神經(jīng)元死亡［10］，同時(shí)Res也能有效抑制KA誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞興奮［11］。本實(shí)驗(yàn)室既往研究也發(fā)現(xiàn) Res具有保護(hù)TLE大鼠的CA1和CA3a區(qū)神經(jīng)元免受損傷的作用，并明顯地抑制MFS，降低了海馬內(nèi)神經(jīng)元同步化放電和癲癇自發(fā)發(fā)作的頻率，具有較好的抗癲癇作用［11］。Res不但能明顯地抑制KA誘導(dǎo)的慢性顳葉癲癇大鼠的癇樣自發(fā)發(fā)作，且對(duì)KA誘導(dǎo)的顳葉癲癇大鼠癲癇不同發(fā)作時(shí)期海馬興奮性/抑制性氨基酸遞質(zhì)比例的失衡有一定的逆轉(zhuǎn)作用［12］。Gupta等指出Res能對(duì)抗KA誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬活性氧(ROS)水平的增加，而ROS可以使大鼠海馬興奮性神經(jīng)元活性增加，推測(cè)Res通過(guò)降低大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平抑制癲癇的發(fā)生［1］。另外，我們之前還發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠CA1區(qū)多個(gè)PS的癲癇樣電活動(dòng)可能是由于錐體細(xì)胞軸突回返形成的突觸聯(lián)系激活了NMDA受體，并和非NMDA受體共同介導(dǎo)，而NMDA受體主要參與癲癇樣電活動(dòng)靠后的PS［13］。因此，Res可能通過(guò)調(diào)節(jié)NMDA受體的功能對(duì)CA1區(qū)誘發(fā)的癲癇樣電活動(dòng)產(chǎn)生部分抑制作用。

Fig 4 Effects of resveratrol with low，middle and high dose on PS in hippocampal CA1 region of rat TLE model

綜上所述，白藜蘆醇可能通過(guò)改善突觸傳遞、降低氧化應(yīng)激或者調(diào)節(jié)受體功能這些機(jī)制來(lái)產(chǎn)生抗癲癇作用，且白藜蘆醇可透過(guò)血腦屏障［14］，這也為臨床治療癲癇提供了依據(jù)。本研究雖然在實(shí)驗(yàn)室之前研究的基礎(chǔ)上通過(guò)腦片灌流技術(shù)進(jìn)一步揭示了白藜蘆醇的抗癲癇作用，但具體的作用機(jī)制亟待進(jìn)行更深入的研究。

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