HPLC法測(cè)定大鼠血漿中色胺酮的濃度及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

李 捷，繆 珊，王四旺，王劍波，謝艷華

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，陜西西安 710032)

色胺酮(tryptanthrin)為吲哚喹啉類(lèi)生物堿，其化學(xué)名稱(chēng)為吲哚［2，1-b］喹唑啉-6，12-二酮(6，12-dihydro-6，12-dioxoindolo-［2，1-b］-quinazoline)，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)Fig 1。主要存在于馬藍(lán)(Strobilanthes cusia)、蓼藍(lán)(Polygonum tinetorium Lour)、菘藍(lán)(Isatis tinctoria L.)等產(chǎn)藍(lán)植物中，現(xiàn)也可通過(guò)微生物發(fā)酵或人工合成得到［1］。近年來(lái)藥理研究表明其具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗瘧和殺蟲(chóng)作用，特別是可以通過(guò)多種途徑對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用。據(jù)報(bào)道，蓼藍(lán)中的色胺酮能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡［2］;Kimoto等［3］也觀察了色胺酮在體外對(duì)多種人白血病細(xì)胞的殺細(xì)胞作用;另有研究表明，色胺酮在低濃度可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，高濃度可通過(guò)caspase-3或Fas抗原途徑誘導(dǎo)凋亡，從而引起細(xì)胞的死亡;Mu［4］研究發(fā)現(xiàn)呈濃度依賴(lài)性抑制培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的DNA合成;Motoki等［5］發(fā)現(xiàn)，色胺酮通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的下游區(qū)域來(lái)抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的惡化、侵襲、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移;Sharma等［6］合成了多個(gè)色胺酮衍生物，并篩選這些化合物對(duì)體外8種、體內(nèi)12種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞株的殺傷活性，結(jié)果顯示大多數(shù)化合物具有細(xì)胞毒活性;Koya-Miyata等［7］的實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)預(yù)防性給予色胺酮，可降低腸道腫瘤的發(fā)生率;繆珊等［8］研究發(fā)現(xiàn)色胺酮還能明顯抑制 MCF-7細(xì)胞增殖并具有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用;還能影響人白血病細(xì)胞株K-562細(xì)胞的增殖和凋亡［9］。但是，色胺酮在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究鮮有報(bào)道。為給色胺酮的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供依據(jù)，本文采用HPLC法建立了大鼠血漿中色胺酮的測(cè)定方法，并測(cè)定大鼠灌胃給予色胺酮后經(jīng)時(shí)血藥濃度，研究其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

Fig 1 Chemical structure of tryptanthrin(a)and internal standard cinnamaldehyde(b)

1 材料

1.1 儀器 日本島津高效液相色譜(HPLC)儀，配有LC-20AT二元泵，SPO-M20A型二極管陣列檢測(cè)器，SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10AS型柱溫箱;KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(德國(guó)賽多利斯);XK-96A快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);TGL-16GB高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);Scietnz 192高通量組織研磨機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);SIMENSBCD-601W無(wú)菌冷藏冷凍冰箱(博西華家用電器有限公司);Millipore超純水器(密理博上海貿(mào)易有限公司);IVC獨(dú)立換氣系統(tǒng)(上海邵豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 桂皮醛對(duì)照品(批號(hào)110710-200212)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(純度均大于98%)，肝素鈉(西安阿爾寶生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，色胺酮由西北大學(xué)生命科學(xué)院提供(純度大于98%)，乙腈(SK chemicals，Korea)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠，體質(zhì)量(280±20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK-(軍)2007－007。

Fig 2 HPLC chromatograms of the assay

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相為乙腈 －水(47∶53)，流速1.0 ml·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng) 251 nm，柱溫 30℃，進(jìn)樣量 20 μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取適量色胺酮對(duì)照品，加入乙腈稀釋配制成質(zhì)量濃度為585.6 mg·L－1的儲(chǔ)備液。精密吸取適量，用乙腈分別稀釋成濃度為 11.712、5.856、2.928、0.723、0.183 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，均于4℃保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱(chēng)取桂皮醛對(duì)照品，用甲醇溶解并稀釋至質(zhì)量濃度為20 mg·L－1，即得內(nèi)標(biāo)工作液，均于4℃保存，備用。

2.2.3 灌胃溶液的配制 稱(chēng)取色胺酮原料藥適量，用0.5%CMC-Na溶液助懸，配制成濃度為5.6 mg·L－1的混懸液，灌胃時(shí)磁力攪拌，使呈均勻的混懸狀態(tài)。

2.3 血漿樣品預(yù)處理 取血漿樣品200 μl，加入內(nèi)標(biāo)桂皮醛溶液20 μl和乙腈500 μl，渦旋混合1 min，再在12 000×g離心15 min，取上清液，即得。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專(zhuān)屬性考察 取大鼠空白血漿、空白血漿加對(duì)照品、灌胃后血漿樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣后所得色譜圖見(jiàn)Fig 2。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下，色胺酮與內(nèi)標(biāo)峰分離良好，無(wú)雜質(zhì)干擾。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和最低定量限考察 分別吸取“2.2.1”項(xiàng)下的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，加入200 μl空白血漿中，配制成相當(dāng)于色胺酮濃度分別為0.0183、0.0723、0.2928、0.5856、1.1712 mg·L－1的血漿樣品。按“2.3”項(xiàng)下操作，以血漿中色胺酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以色胺酮和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，用最小二乘法回歸運(yùn)算，得到直線回歸方程為 Y=3.608 5X－0.082 1，r2=0.999。結(jié)果表明色胺酮質(zhì)量濃度在0.0183～1.1712 mg·L－1線性關(guān)系良好。按以上條件測(cè)得血漿中色胺酮的最低定量限為0.02 mg·L－1。

2.4.3 準(zhǔn)確度、精密度考察 按“2.3”項(xiàng)下操作，制備低、中、高 3個(gè)濃度(分別為 0.0732、0.2928、0.5856 mg·L－1)的質(zhì)量控制樣品(Quality control QC)，每個(gè)濃度分別制備6個(gè)樣本，重復(fù)3個(gè)分析批，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度，與配制濃度比較，得到本方法的準(zhǔn)確度和精密度。連續(xù)檢測(cè)3 d，結(jié)果表明，日內(nèi)、日間精密度分別為2.15%～3.05%和4.62% ～6.80%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，測(cè)定大鼠血漿中色胺酮的分析方法符合中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(State Food and Drug Administration，SFDA)有關(guān)的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究的指導(dǎo)原則要求。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 經(jīng)考察低、中、高3個(gè)濃度(分別為0.0732、0.2928、0.5856 mg·L－1)色胺酮在反復(fù)凍融3次，－20℃貯存15 d，室溫放置4 h條件下的RSD分別在3.54% ～8.77%、3.79% ～9.05%、4.21% ～9.20%(n=6)，說(shuō)明在測(cè)定條件下樣品穩(wěn)定。

2.4.5 提取回收率 以對(duì)照品溶液配制方法，配制成色胺酮低、中、高 3個(gè)濃度(分別為 0.0732、0.2928、0.5856 mg·L－1)的對(duì)照品溶液，再取大鼠空白血漿200 μl，用一定濃度的色胺酮對(duì)照品配制成相應(yīng)濃度的色胺酮血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下操作，每一樣品進(jìn)行6樣本分析，以血漿中色胺酮的峰面積與對(duì)照品溶液的峰面積的比，評(píng)價(jià)本方法的提取回收率。色胺酮在低、中、高3個(gè)濃度下的血漿樣品提取回收率分別為97.04%、95.26%和97.89%。結(jié)果見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Recovery of the assay for tryptanthrin in rat plasma(±s，n=6)

Tab 1 Recovery of the assay for tryptanthrin in rat plasma(±s，n=6)

Plasma concentration/mg·L－1Extraction recovery RSD/%0.0732 95.26 ±1.04 1.08 0.2928 97.04 ±0.56 0.58 0.5856 97.89 ±9.48 0.49

2.5 色胺酮在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

2.5.1 樣本的采集與處理 SD大鼠♀♂各5只，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，給藥前12 h至實(shí)驗(yàn)期間禁食不禁水。按56 mg·kg－1單劑量灌胃［10］，分別于給藥前和給藥后 1、2、3、4、6、8、10、12、23 h 眼眶取血0.5 ml，置于肝素化PE管中，輕微振搖后4 000×g離心15 min，取血漿于－20℃保存，備用。

2.5.2 血藥濃度-時(shí)間曲線關(guān)系及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 灌胃給藥后，色胺酮在♀♂大鼠體內(nèi)的平均藥時(shí)曲線見(jiàn)Fig 3。血藥濃度數(shù)據(jù)采用DAS 2.1.1軟件進(jìn)行分析，色胺酮的體內(nèi)過(guò)程符合二室開(kāi)放模型，以藥物半衰期(T)、達(dá)峰濃度(Cmax)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)和藥時(shí)曲線下面積(AUC)等參數(shù)表征該藥物的藥動(dòng)學(xué)特征，結(jié)果見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of tryptanthrin after oral administration at a single dose of 56 mg·kg-1to female and male SD rats(±s，n=5)

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of tryptanthrin after oral administration at a single dose of 56 mg·kg-1to female and male SD rats(±s，n=5)

Parameters Unit Female Male Mean SD T Mean SD 1 2β h 10.73 14.28 10.17 15.79 K21 h－1 0.221 0.198 0.323 0.238 K10 h－1 28.25 54.74 3.421 3.587 K12 h－1 0 0 0 0 Cmax mg·L －1 1.887 1.093 2.620 0.538 Tmax h 5.200 1.095 4.600 1.342 MRT0→∞ h 9.041 2.176 8.310 2.236 Vz/F L·kg－1 37.68 42.75 34.78 30.92 T h 1.503 0.877 1.279 0.285 T 1 2α 1 2z h 4.314 2.610 5.597 4.694 AUC0→∞ mg·h·L －1 12.51 5.285 14.70 3.310 CL L·kg－1·h－15.752 2.960 3.982 0.999

Fig 3 Mean plasma tryptanthrin concentration versus time profiles after oral administration at a single dose of 56 mg·kg-1 in male(A)and female(B)SD rats(n=5)

3 討論

優(yōu)化HPLC色譜條件時(shí)，比較了流動(dòng)相不同比例的甲醇 － 水［11－12］、乙腈 － 水，結(jié)果乙腈 － 水(47∶53)時(shí)內(nèi)標(biāo)物和色胺酮的保留時(shí)間恰當(dāng)，峰形良好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)不干擾樣品的分離測(cè)定。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇時(shí)，對(duì)色胺酮進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果251 nm時(shí)吸收最大，最終確定251 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。內(nèi)標(biāo)選擇時(shí)，曾試過(guò)靛藍(lán)和靛玉紅做內(nèi)標(biāo)［13］，但由于在相同的色譜條件下，較短時(shí)間內(nèi)很難得到理想分離度和峰形，而桂皮醛的色譜行為與色胺酮相似，在較短時(shí)間內(nèi)能很好的分離，并且提取回收率相近，故選擇桂皮醛為內(nèi)標(biāo)。

樣品制備時(shí)，比較了甲醇沉淀蛋白和乙腈沉淀蛋白，分別用乙酸乙酯、三氯甲烷萃取后4 000×g離心，結(jié)果在色譜峰中均有保留時(shí)間較長(zhǎng)的色譜峰影響當(dāng)前樣品或下一樣品的分析。后又改用500 μl乙腈沉淀蛋白，并直接12 000×g高速離心，結(jié)果樣品中被測(cè)峰和內(nèi)標(biāo)峰分離度均較好，并且對(duì)當(dāng)前樣品和下一樣品均沒(méi)干擾，故終確定了文中的處理方法。經(jīng)在藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用，驗(yàn)證了本文所建色胺酮HPLC的檢測(cè)方法在非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究中的適用性，為其非臨床藥代及毒代動(dòng)力學(xué)等安全性研究提供了可靠的分析方法。

考察擬開(kāi)發(fā)新藥是否有發(fā)展前途，優(yōu)良的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)是重要的指標(biāo)之一。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，灌胃給予色胺酮后，其在♀和♂大鼠體內(nèi)的Tmax均較大，分別為5.2 h和4.6 h，T12分別為4.3 h和5.6 h，提示色胺酮在大鼠體內(nèi)吸收和消除均較緩慢;K12，K10，K21分別表明色胺酮主要從中央室消除和從周邊室向中央室轉(zhuǎn)運(yùn)，并且分布廣泛;表觀分布容積(AUC0→∞)分別為 12.5 和 14.70 mg·h·L－1，也提示色胺酮在大鼠體內(nèi)分布廣泛。血藥濃度－時(shí)間曲線數(shù)據(jù)顯示，色胺酮能在血液中較長(zhǎng)時(shí)間保持一定血藥濃度，屬于一種長(zhǎng)效機(jī)制，但是否會(huì)引起長(zhǎng)期蓄積毒性反應(yīng)，還有待于今后深入研究。

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