復(fù)方肌苷口服液中肌苷含量的兩種測(cè)定方法比較

陳葉琴，唐風(fēng)雷，于忠興

(江蘇省常州市第三醫(yī)院藥劑科，江蘇 常州 213001)

肌苷為輔酶類(lèi)藥物，能參與體內(nèi)能量代謝及蛋白質(zhì)的合成，具有提高各種酶(特別是輔酶A)的活性及改善機(jī)體代謝作用，用于各種肝臟疾病、心臟病、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、中心視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等。復(fù)方肌苷口服液為我院自制制劑，肌苷含量測(cè)定的方法采用的是《江蘇省藥品標(biāo)準(zhǔn)》[1]中的紫外分光光度法(UV法)，而中國(guó)藥典[2]中肌苷制劑含量測(cè)定采用的是高效液相色譜(HPLC)法，現(xiàn)采用兩種方法測(cè)定肌苷含量并進(jìn)行比較，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－10AT型高效液相色譜儀，SPD－10A型檢測(cè)器，島津N2000型色譜數(shù)據(jù)工作站;TU－1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。肌苷對(duì)照品(河南新鄉(xiāng)華星藥廠，批號(hào)為1001061);復(fù)方肌苷口服液(本院自制，批號(hào)分別為100714，100812，100916，規(guī)格為 20 mL/支，肌苷含量 0.4 g);甲醇為色譜純，水為二次純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 UV 法

2.1.1 溶液制備

精密稱(chēng)取肌苷30.50 mg，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得肌苷質(zhì)量濃度為305μg/mL)的對(duì)照品溶液。精密吸取復(fù)方肌苷口服液5.0 mL(約相當(dāng)于100 mg)，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，再精密吸取稀釋液1 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按處方比例配成不含肌苷的溶液，按供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.1.2 波長(zhǎng)確定

吸取對(duì)照品貯備溶液1.0 mL，置25 mL容量瓶中，加水至刻度，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果溶液在248 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，而陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾，故選定248 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密吸取對(duì)照品貯備溶液 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 mL，分別置 50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，以水為空白，在248 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行回歸，得回歸方程 A=0.04597C－0.00587，r=0.9999，肌苷的質(zhì)量濃度線性范圍為 3.05 ～24.4μg/mL。

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液(12.2μg/mL)，依法重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果的 RSD=0.61%，表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，室溫放置，分別于 0，1，3，5，10，24 h時(shí)在248 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果的 RSD=1.12%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn):精密吸取已知含量的樣品2.5 mL(批號(hào)為100916，含肌苷 49.40 mg)，分別加入肌苷對(duì)照品約 30，50，70 mg，置 100 mL容量瓶中，照2.1.1項(xiàng)下方法制備溶液，在248 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.1.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制成供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 HPLC 法

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－ 水(10 ∶90);檢測(cè)波長(zhǎng):248 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)量樣:20 μL。在該色譜條件下，肌苷的保留時(shí)間約為6 min。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.2 溶液制備

精密稱(chēng)取肌苷51.20 mg，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得肌苷質(zhì)量濃度為512μg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取復(fù)方肌苷口服液5.0 mL(約相當(dāng)于100 mg)，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，再精密吸取稀釋液2 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，用0.45 μm的濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密吸取對(duì)照品貯備液 2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL，分別置 100 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20 μL以各質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得回歸方程 Y=55452 X－6705.4(r=0.9999)。結(jié)果表明，肌苷質(zhì)量濃度在10.24～35.84μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液(20.48μg/mL)，按擬訂的色譜條件進(jìn)樣6次，結(jié)果的 RSD=0.70%，表明該法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0，1，3，5，10，24 h時(shí)分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD=1.23%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn):精密吸取已知含量的樣品 2.5 mL(批號(hào)為100916，含量 49.40 mg)，分別加入對(duì)照品約 30，50，70 mg，置 100 mL容量瓶中，照2.2.2項(xiàng)下方法制備溶液，依法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取對(duì)照品溶液4 mL(含肌苷2048μg)，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，取此對(duì)照品溶液和3批樣品按2.2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液各20 μL，分別注入色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果比較(標(biāo)示量%，，n=3)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果比較(標(biāo)示量%，，n=3)

3 討論

復(fù)方肌苷口服液除含有肌苷外，還有硒酸脂多糖，但在248 nm波長(zhǎng)處不干擾，故樣品可不經(jīng)處理直接測(cè)定。本試驗(yàn)分別采用UV法和HPLC法對(duì)3批樣品中肌苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而UV法更具有操作簡(jiǎn)單，方法便捷、快速，費(fèi)用低廉，更適合生產(chǎn)時(shí)中間體含量及醫(yī)院制劑測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)。

[1]江蘇省衛(wèi)生局.江蘇省藥品標(biāo)準(zhǔn)[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1985:38.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:205.