HPLC法測定注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（2∶1）的含量

黃 琦，季曉娟

（浙江科技學院 生物與化學工程學院，杭州310023）

頭孢哌酮鈉（cefopcrazone sodium，CPZ）和舒巴坦鈉（sulbactam sodium，SBT）（2∶1）組成的復(fù)方制劑不但對陰性桿菌顯示明顯的協(xié)同抗菌活性，聯(lián)合后的抗菌作用是單獨用頭孢哌酮的4倍。本品對金葡萄球菌，G－桿菌產(chǎn)生的β－內(nèi)酰胺酶有很強的抑制作用，臨床上用于多種感染疾病的治療［1－2］。頭孢哌酮鈉產(chǎn)品中除藥用形式R構(gòu)型外，還有對革蘭陰性桿菌幾乎無效的S異構(gòu)體、堿性降解產(chǎn)物B、未知雜質(zhì)等，嚴重影響著產(chǎn)品質(zhì)量［3－4］。該復(fù)方制劑含量測定方法需能同時測定頭孢哌酮鈉與舒巴坦鈉，且主藥與頭孢哌酮S異構(gòu)體、頭孢哌酮堿性降解產(chǎn)物B及頭孢哌酮未知雜質(zhì)達到同時分離。該復(fù)方制劑按中國藥典（2010版）收載的注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的含量測定方法［5］，色譜條件的適用性不能滿足測定要求，不同的色譜柱頭孢哌酮和其S異構(gòu)體之間的分離度差異較大，有的難以達到規(guī)定要求。本研究探討了頭孢哌酮鈉和舒巴坦鈉（2∶1）含量測定用流動相，所確定的色譜條件改善了頭孢哌酮和S異構(gòu)體的分離度，同時改善了舒巴坦和頭孢哌酮未知雜質(zhì)的分離度；該方法準確、可靠，具有較好的適用性。

1 儀器與試藥

島津LC－10AT液相色譜儀，島津SPD－10A紫外檢測器，島津ODS色譜柱（150mm×6.0mm，5μm），島津UV－2100紫外可見掃描儀，pHS－25型酸度計。

頭孢哌酮對照品（質(zhì)量分數(shù)94.4%），舒巴坦對照品（質(zhì)量分數(shù)92.0%），頭孢哌酮S異構(gòu)體對照品，頭孢哌酮降解物B對照品，均為中國藥品生物制品檢定所提供；注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（深圳制藥廠，批號101201，101202，101203）；乙腈（色譜純），10%四丁基氫氧化銨水溶液（上海試劑一廠），磷酸二氫鉀（化學純）。

2 實驗方法及結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇

圖1 4種化合物的紫外掃描譜圖Fig.1 UV spectrum of 4kinds of chemicals

取頭孢哌酮對照品、舒巴坦對照品、頭孢哌酮S異構(gòu)體、頭孢哌酮降解物B各10mg，精密稱定。頭孢哌酮對照品和S異構(gòu)體先用少量pH7.0磷酸鹽緩沖液溶解，再用流動相稀釋至刻度；頭孢哌酮B降解物先用少量乙腈溶解，再用流動相稀釋至刻度；舒巴坦用流動相溶解并稀釋至刻度。配成質(zhì)量濃度為20μg/mL的溶液，在UV－2100紫外可見掃描儀掃描得紫外光譜（圖1）。由于舒巴坦的吸收偏低且含量較小，其他3個成分在吸收峰的平坦處，故選擇220nm作為檢測波長。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

十八烷基硅烷鍵合相為固定相；流動相為乙腈－水相（23∶77），水相為濃度0.005mol/L氫氧化四丁基銨和0.05mol/L KH2PO4溶液；pH5.0；流速1.0mL/min；檢測波長220nm；進樣量20μL；室溫。同時精密稱取頭孢哌酮對照品、舒巴坦對照品、頭孢哌酮S異構(gòu)體對照品及頭孢哌酮降解物B對照品適量，頭孢哌酮對照品和頭孢哌酮S異構(gòu)體對照品先用少量pH7.0磷酸鈉緩沖液溶解，降解物B對照品先以乙腈溶解，再加流動相稀釋成頭孢哌酮、頭孢哌酮降解物B、頭孢哌酮S異構(gòu)體質(zhì)量濃度為0.3mg/mL，舒巴坦質(zhì)量濃度為0.15mg/mL的混合溶液，進樣測試。頭孢哌酮峰與頭孢哌酮S異構(gòu)體峰的分離度，舒巴坦峰與未知雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)不小于1.0。

結(jié)果表明，色譜圖中相鄰兩峰的分離度良好（圖2），理論塔板數(shù)按頭孢哌酮峰計算大于3 000，系統(tǒng)適用性試驗符合規(guī)定。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖Fig.2 Chromatogram of system suitability test

2.3 標準曲線

2.3.1 頭孢哌酮和舒巴坦標準儲備液的制備

精密稱取頭孢哌酮對照品25.0 mg，舒巴坦對照品12.5mg，置25 mL容量瓶中，先用少量pH7.0磷酸鹽緩沖液溶解，再用流動相稀釋至刻度，混勻，配成頭孢哌酮1.0mg/mL、舒 巴 坦 0.5mg/mL 標 準 儲備液。

2.3.2 標準曲線

精密吸取上述標準儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置 6 個10mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，即配成含頭孢哌酮0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，舒巴坦0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL的系列標準溶液。照上述色譜條件測定。經(jīng)回歸計算，色譜峰面積（A）與質(zhì)量濃度（C）在頭孢哌酮0.049～0.49mg/mL，舒巴坦0.024～0.24mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：

頭孢哌酮A＝1.87×107C＋4.10×104，r＝0.999 4

舒巴坦A＝3.69×106C＋4.11×103，r＝0.999 1

2.4 進樣精密度

取頭孢哌酮質(zhì)量濃度為0.2mg/mL，舒巴坦質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的標準溶液20μL進樣，連續(xù)測定6次，計算其相對標準偏差（RSD），分別為0.73%，0.70%，見表1。

表1 精密度測定結(jié)果（n＝6）Table 1 Determination results of precision（n＝6）

2.5 檢測限

取上述制備標準曲線用最低質(zhì)量濃度的頭孢哌酮和舒巴坦標準溶液，采用逐步稀釋法，檢測限以信噪比S/N＝3確定。結(jié)果表明，頭孢哌酮的檢測限為1.0ng，舒巴坦的檢測限為2.0ng。

2.6 回收率試驗

精密稱取20倍處方量已知含量的舒巴坦原料9份，各加入精密稱取已知含量的頭孢哌酮原料，稱樣量為20倍處方量的80%、100%、120% 各3份，混合均勻制成模擬樣，精密稱取模擬樣適量（約相當于頭孢哌酮12、15、18mg），分別置于50mL容量瓶中；同樣精密稱取20倍處方量已知含量的頭孢哌酮原料9份，各加入精密稱取已知含量的舒巴坦原料，稱樣量為20倍處方量的80%、100%、120%各3份，混合均勻制成模擬樣，精密稱取模擬樣適量（約相當于舒巴坦6.0、7.5、9.0mg），分別置于50mL容量瓶中；用流動相稀釋至刻度。

另精密稱取頭孢哌酮、舒巴坦對照品，先用少量pH7.0磷酸鹽緩沖液溶解，再用流動相稀釋至刻度，混勻，配成頭孢哌酮0.3mg/mL、舒巴坦0.15mg/mL標準儲備液，按上述色譜條件進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，本方法回收率較好，兩成分互不干擾。

2.7 樣品含量測定

取廠家3個批號注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（2∶1）適量，分別精密稱定，制成含頭孢哌酮3.0mg/mL，舒巴坦1.5mg/mL的溶液，按照上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。3批樣品測定結(jié)果見表3。

表2 回收率試驗（n＝9）Table 2 Recovery test（n＝9） %

表3 樣品測定結(jié)果（n＝3）Table 3 Determination results of samples in different batches（n＝3） %

3 討 論

3.1 中國藥典（2010版）收載方法的流動相分離情況考察

中國藥典（2010版）收載的注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉含量測定的流動相：0.005mol/L氫氧化銨四丁基溶液（取40%氫氧化四丁基銨溶液6.6mL，加水1 800mL后，用1mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，再用水稀釋至2 000mL，搖勻）—乙腈（750∶250）檢測波長220nm［5］。在該色譜條件下，頭孢哌酮峰和S異構(gòu)體峰的分離度較好，但是兩者峰形不尖銳，有些拖尾，并且保留時間較長（大于30min）；舒巴坦色譜峰前有一未知雜質(zhì)，和舒巴坦峰的分離度小于1.0。

3.2 流動相組成對被測組分色譜分離的影響

流動相有乙腈比例、pH值、KH2PO4溶液質(zhì)量濃度、氫氧化四丁基銨溶液質(zhì)量濃度4個可變因素，用正交試驗優(yōu)選色譜條件發(fā)現(xiàn)：氫氧化四丁基銨溶液質(zhì)量濃度可以增加舒巴坦的保留；磷酸鹽緩沖液可改善頭孢哌酮和S異構(gòu)體的峰形和分離度及改變B降解物的峰位；pH值對各峰的保留時間均有影響；流動相中乙腈比例影響最大，尤其對頭孢哌酮的保留時間影響較大。當水相與乙腈的比為77∶23時，可使相鄰峰的分離度達到要求，各峰峰寬較合適，且保留時間較為適宜（未知雜質(zhì)6.665min，舒巴坦7.068min，B降解物8.715min，頭孢哌酮18.665min，頭孢哌酮S異構(gòu)體20.265min）；流動相中水相的pH值在4～6范圍內(nèi)，對舒巴坦和頭孢哌酮未知雜質(zhì)的分離度影響較大，當pH5.0時，可使舒巴坦和頭孢哌酮未知雜質(zhì)的分離度符合要求（R＞1.0）；用KH2PO4緩沖液保持流動相的離子強度和pH值一定，當KH2PO4的質(zhì)量濃度為0.05mol/L時，有利于獲得對稱的色譜峰和重現(xiàn)的分離結(jié)果。

4 結(jié) 語

本研究探討了注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（2∶1）含量測定用流動相，改進后的流動相改善了頭孢哌酮和S異構(gòu)體、舒巴坦和頭孢哌酮未知雜質(zhì)的分離度，相鄰兩組分的分離度均不小于1.0，且保留時間較為適宜，優(yōu)于中國藥典（2010版）收載的流動相。所確定的色譜條件能準確、快速地測定該復(fù)方制劑中頭孢哌酮鈉和舒巴坦鈉的含量。

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