黑根霉RN-M246催化甾體的11α-羥基化培養(yǎng)基研究

胡曦予，崔 勵(lì)，馮 魁

(大連工業(yè)大學(xué)輕工與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

甾體類藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，隨著需求量的不斷增大，其合成技術(shù)也得到了越來越廣泛和深入的研究[1]。甾體類藥物的傳統(tǒng)化學(xué)合成方法步驟繁瑣、副產(chǎn)品多、產(chǎn)率低且環(huán)境污染嚴(yán)重，而微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)具有專一性強(qiáng)、產(chǎn)率高、條件溫和、污染少等諸多優(yōu)點(diǎn)，而且其轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型十分豐富[2]，因此越來越受到重視。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androst-4-ene-3,17-dione，AD)是制造甾體激素類藥物的關(guān)鍵中間體，常用于制備孕激素、雄激素、皮質(zhì)激素、避孕藥等[3]，在甾體母核引入羥基，可使其抗炎活性大大增強(qiáng)。其11α-羥基化獲得的11α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮是制備治療高血壓及充血性心力衰竭的新型藥物的關(guān)鍵中間體，且臨床療效優(yōu)于其它同類藥物[4]。

作者采用微生物轉(zhuǎn)化法，以黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-M246催化底物雄甾-4-烯-3，17-二酮進(jìn)行11α-羥基化反應(yīng)，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基，以使其有利于菌體生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)化，擬為11α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與試劑

黑根霉RN-M246，清華大學(xué)生命科學(xué)院。

雄甾-4-烯-3,17-二酮，Sigma公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：小米培養(yǎng)基，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30，玉米漿20，蠶蛹粉10，硫酸銨1，磷酸氫二鉀5，pH值5.0。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

黑根霉斜面中加適量無菌水，將孢子洗下，紗布過濾，充分振蕩，制成1×107～1×108個(gè)·mL-1孢子懸液。

1.3.2 搖瓶轉(zhuǎn)化

在500 mL擋板搖瓶中加入75 mL發(fā)酵培養(yǎng)基和10 mmol·L-1的底物，滅菌后超聲，接入4%的菌懸液，在28 ℃、160 r·min-1條件下轉(zhuǎn)化24 h，其后提高轉(zhuǎn)速至220 r·min-1繼續(xù)轉(zhuǎn)化48 h。

1.3.3 HPLC分析

將發(fā)酵液高速離心，取上清液用甲醇稀釋，稀釋液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，作為檢測(cè)樣品，進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：C18烷基硅烷鍵合反相柱；流動(dòng)相為甲醇-水(3∶2，體積比)；流速0.8 mL·min-1；色譜柱溫25 ℃；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)242 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

碳源是培養(yǎng)基組成的重要成分之一，是菌體生長(zhǎng)所需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也影響著轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程。固定發(fā)酵培養(yǎng)基中其它組分不變，分別考察不同碳源(30 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、麥芽浸粉、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精、糖蜜)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可知，葡萄糖與糊精作為培養(yǎng)基碳源時(shí)的轉(zhuǎn)化率較高。其中，葡萄糖較易被微生物利用并轉(zhuǎn)化成菌體生長(zhǎng)所需的能量和碳成分，且價(jià)廉易得，廣泛應(yīng)用于微生物實(shí)驗(yàn)和工業(yè)化生產(chǎn)。因此，選用葡萄糖為最佳碳源。

2.2 速效有機(jī)氮源對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

速效有機(jī)氮源中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠快速而直接地被菌體吸收利用，使得菌體能在較短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)，增加菌絲濃度。碳源為葡萄糖，固定發(fā)酵培養(yǎng)基中其它組分不變，分別考察不同速效有機(jī)氮源(20 g·L-1的蛋白胨、玉米漿、酵母浸粉、酵母浸膏、牛肉浸膏)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同速效有機(jī)氮源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可知，蛋白胨為速效有機(jī)氮源時(shí)的轉(zhuǎn)化率最高，較原培養(yǎng)基中的玉米漿提高了8%。因此，選擇蛋白胨為最佳速效有機(jī)氮源。

2.3 遲效氮源對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

黑根霉轉(zhuǎn)化AD實(shí)驗(yàn)采用一步轉(zhuǎn)化法，其發(fā)酵周期較長(zhǎng)，在培養(yǎng)基中加入遲效氮源利于發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給及代謝產(chǎn)物的形成。碳源為葡萄糖、速效有機(jī)氮源為蛋白胨，固定發(fā)酵培養(yǎng)基其它組分不變，考察不同遲效氮源(10 g·L-1的蠶蛹粉、冷榨豆粉、熱榨豆粉、麩質(zhì)粉、玉米蛋白粉)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同遲效氮源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可知，冷榨豆粉作為遲效氮源時(shí)的轉(zhuǎn)化率最高，相對(duì)于原培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化率提高了5%。因此，選用冷榨豆粉為最佳遲效氮源。

2.4 無機(jī)氮源對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

碳源為葡萄糖、速效有機(jī)氮源為蛋白胨、遲效氮源為冷榨豆粉，固定發(fā)酵培養(yǎng)基其它組分不變，考察不同無機(jī)氮源(1 g·L-1的乙酸銨、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、檸檬酸三銨)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同無機(jī)氮源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖4可知，硫酸銨和檸檬酸三銨有助于轉(zhuǎn)化率的提高。其中，添加硫酸銨的培養(yǎng)基所生長(zhǎng)的菌體較易成團(tuán)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降，而添加檸檬酸三銨的培養(yǎng)基所生長(zhǎng)的菌體分散均勻，在較快的轉(zhuǎn)速下仍不成團(tuán)，保證了轉(zhuǎn)化過程的順利進(jìn)行，其原因是檸檬酸三銨不僅提供了氮源，還起到了穩(wěn)定和分散的作用。因此，選用檸檬酸三銨為最佳無機(jī)氮源。

2.5 pH值對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

pH值是影響菌體生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)化過程的重要因素之一，不僅影響菌體的生長(zhǎng)，同時(shí)也影響酶活性。在上述優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，考察發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖5可知，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為5.0時(shí)的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到48.4%，較原培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化率提高了約13%。因此，選用發(fā)酵最佳pH值為5.0。

3 結(jié)論

采用微生物轉(zhuǎn)化法，以黑根霉RN-M246催化雄甾-4-烯-3,17-二酮11α-羥基化反應(yīng)，考察了發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。研究發(fā)現(xiàn)：常用作分散劑的檸檬酸三銨是菌體形態(tài)的主要影響因素，有效地改善了菌體易成團(tuán)的現(xiàn)象，且菌量適中，均勻分散；蛋白胨含有較豐富的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，作為速效有機(jī)氮源更有利于菌體在前期成長(zhǎng)；而黑根霉的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)化時(shí)間較長(zhǎng)，添加遲效氮源冷榨豆粉能夠保證發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)的供給，使菌絲體持續(xù)生長(zhǎng)并進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

確定優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)為：葡萄糖30、蛋白胨20、冷榨豆粉10、檸檬酸三銨1、磷酸氫二鉀5、pH值5.0，在此條件下，可提高轉(zhuǎn)化率約13%，最終轉(zhuǎn)化率達(dá)48.4%。

[1] 郭一平，鄭璞.甾體微生物C11α-羥化反應(yīng)的研究進(jìn)展[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32(4):437-441.

[2] 張麗青.微生物轉(zhuǎn)化在甾體藥物合成中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1985,18(1):27-41.

[3] 楊英，姜紹通.微生物降解甾醇側(cè)鏈轉(zhuǎn)化雄甾-4-烯-3,17-二酮的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006,33(6)：142-145.

[4] Davis K L,Nappi J M.The cardiovascular effects of eplerenone,a selective aldosterone-receptor antagonist[J].Clinical Therapeutics，2003,25(11):2647-2668.