無啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化策略用于分離組織特異性啟動(dòng)子的研究

吳旭乾，何光源

(1.武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院環(huán)境與生化工程系，湖北 武漢 430205；2.華中科技大學(xué)生命學(xué)院，湖北 武漢 430074)

啟動(dòng)子按作用方式可分為廣譜啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。近年來,人們相繼分離、鑒定了許多特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子,如玉米醇溶蛋白基因B4 啟動(dòng)子、水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動(dòng)子、大豆7S 種子特異性啟動(dòng)子[1]、水稻花藥特異表達(dá)基因啟動(dòng)子[2]、煙草花藥特異表達(dá)基因啟動(dòng)子[3]等，但麥類作物的此類啟動(dòng)子報(bào)道甚少。

tritordeum[4]為硬粒小麥(Triticumdurum)和大麥(Hordeumchilense)的雜交種，其基因組含有小麥的AA、BB和大麥的HchHch。供試材料轉(zhuǎn)基因tritordeum中使用的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體的構(gòu)建如下：首先從pAct1-DGUS中用雙酶切BamHⅠ/XbaⅠ分離出細(xì)菌uidA基因和nos終止子片段；隨后引入到pBluescriptⅡ骨架形成質(zhì)粒pPLGUS；再從pAHCI7中以酶切Bg/Ⅱ/BamHⅠ獲得含有來源于玉米的40 bp的外顯子序列和ubiquitin-1內(nèi)含子序列，已知該序列的插入會(huì)增強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)，有利于檢測出所標(biāo)定的弱啟動(dòng)子序列，并將其克隆到pPLGUS的BamHⅠ位點(diǎn)，最后形成轉(zhuǎn)化載體——pPLubiGUS，如圖1所示[5]。

圖1 含無啟動(dòng)子標(biāo)記載體的部分結(jié)構(gòu)

基因槍法是小麥遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最為廣泛的一種方法，以植物組織、愈傷組織、懸浮細(xì)胞系、甚至直接以胚作為轉(zhuǎn)受體，具有無宿主限制、靶受體類型廣泛、可控度高、操作簡便快速等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)將pPLubiGUS載體轉(zhuǎn)化到受體材料tritordeum中，得到了一批轉(zhuǎn)基因材料，為無啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化策略用于分離組織特異性啟動(dòng)子的研究提供了可能性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

生長期的轉(zhuǎn)基因植株：以tritordeum為受體的轉(zhuǎn)基因材料的后代經(jīng)過種子的發(fā)芽處理、播種、日?？醋o(hù)等過程得到。

NLS(Nuclei lysis solution)，PPS(Protein precipitate solution)，10×RNase緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris，15 mmol·L-1NaCl，pH值7.5)，RNase溶液(10 mg·mL-1)，異丙醇，100×TE緩沖溶液(1 mol·L-1Tris-HCl，0.1 mol·L-1EDTA)，液氮，10×TBE緩沖溶液，EB溶液，瓊脂糖凝膠，6×載樣緩沖溶液，λDNA Marker，X-Gluc緩沖溶液，Triton X-100，70%～100%梯度乙醇等。

T1 Thermocycler；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；精密pH計(jì)；HH-W21-420型多用恒溫水箱；Gel-doc型凝膠成像儀，BIO-RAD公司；紅外線加熱微波爐；303AS-2型電熱培養(yǎng)箱；96孔微滴定板；XSJ-2型光學(xué)顯微鏡；數(shù)碼攝影機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 葉片總DNA的提取

葉片總DNA的提取參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增uidA基因

(1)引物設(shè)計(jì)

基于uidA序列設(shè)計(jì)引物：

上游P1：5′-AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC-3′

下游P2：5′-ATCGCCGCTTTGGACATACCAT-CCGTA-3′

分別起始于uidA序列的376、1431位點(diǎn)。

(2)PCR反應(yīng)體系

DNA模板1.0 μL、引物P1和P2各0.2 μL、AB1.1 Master mixture 9.7 μL，混勻。

(3)PCR運(yùn)行程序

94 ℃變性4 min；60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，94 ℃變性30 s，30個(gè)循環(huán)；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸8 min；4 ℃ 保溫。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

根據(jù)欲分離DNA片斷大小配制適宜濃度的瓊脂糖溶液，檢測總DNA時(shí)用0.6%凝膠，檢測PCR產(chǎn)物時(shí)用1.0%凝膠；待熔化的凝膠稍冷卻后加入EB溶液，使終濃度達(dá)到0.5 μg·mL-1，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合均勻；電泳結(jié)束，用凝膠成像系統(tǒng)檢測EB染色的凝膠。

1.2.4 GUS組織化學(xué)檢測

由于uidA基因的表達(dá)產(chǎn)物是β-葡糖醛酸酶，若以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)為反應(yīng)底物，在酶的活性部位會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，顯微觀察即可分析uidA表達(dá)的組織特異性。

取材部位：三葉期(葉尖、葉中、葉基、葉鞘及根尖)、3～4個(gè)分蘗期(葉尖、葉中、葉基、葉鞘及根尖)、剛抽穗之前兩節(jié)點(diǎn)及中間部分、幼穗、發(fā)育早期的花藥及花粉粒、成熟期花藥及花粉粒。

檢測步驟：將72 μL X-Gluc緩沖溶液加入到微孔板中，再加入0.1 BV的1% Triton X-100；將植物材料切成小片段，用70%乙醇漂洗后再用無菌雙蒸水清洗，置于含X-Gluc的微孔中；用粘性蓋或Nescofilm密封微孔板，置于潮濕間內(nèi)，防止小體積溶液蒸發(fā)干燥；37 ℃過夜，然后于室溫放置2～3 d(37 ℃是酶反應(yīng)的最適溫度，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，而室溫放置會(huì)使顏色加深)；若材料呈深綠色，藍(lán)色顯色反應(yīng)將難以檢測?？捎?0%～100%梯度乙醇代替X-Gluc緩沖溶液去除葉綠素(根據(jù)顏色深淺可多次重復(fù))，用1 mol·L-1Tris-HCl(pH值9.5)代替乙醇置4 ℃長時(shí)間保存；記錄藍(lán)色顯色反應(yīng)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

提取出的葉片總DNA用0.6%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果，結(jié)果見圖2。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖3)

1.DNA Marker Ⅱ 2.陽性對照B73-6-1 3～11.供試樣品

兩引物間的物理距離為1055 bp，uidA基因的PCR結(jié)果顯陽性的單株，其特異性的擴(kuò)增條帶應(yīng)與此相當(dāng)。由圖3可看出，4#、7#供試樣品含有uidA基因。

2.3 GUS組織化學(xué)檢測結(jié)果

2.3.1 陽性對照材料中Gus的表達(dá)情況

陽性對照材料B73-6-1(uidA由廣譜型啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)表達(dá))中外源Gus的表達(dá)結(jié)果見圖4。

a～f：根，葉，葉基，發(fā)育早期的花藥，花藥，花粉粒

由圖4可看出，陽性對照材料的各組織部位均出現(xiàn)了uidA的強(qiáng)烈表達(dá)。

2.3.2 供試材料中Gus的表達(dá)情況

經(jīng)PCR所篩選出的轉(zhuǎn)基因tritordeum中外源Gus的表達(dá)結(jié)果見圖5。

a～f：葉片，根，幼穗，發(fā)育早期的花藥，花藥，花粉粒

由圖5可看出，除了幼穗中花藥原基部位有β-葡糖醛酸酶活性外，其它組織或器官中均未發(fā)現(xiàn)有Gus表達(dá)的現(xiàn)象。

2.4 討論

應(yīng)用已知的基因序列和未知基因進(jìn)行分離，是目前常用的啟動(dòng)子分離策略。第一種方法已經(jīng)應(yīng)用了很長時(shí)間，主要是利用已知基因序列制得的探針來搜尋基因文庫，或者是從已知基因序列的5′端進(jìn)行“步移技術(shù)”(Walking)。第二種是基因標(biāo)記(Tagging)探索技術(shù)，通過將無啟動(dòng)子的標(biāo)記基因(如Gus)導(dǎo)入受體細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，標(biāo)記調(diào)節(jié)序列的效果通過檢測轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的表達(dá)情況來確定[6]，這種方法已被成功地應(yīng)用于擬南芥、土豆和煙草等植物的調(diào)節(jié)序列的標(biāo)記[7]。有時(shí)，在構(gòu)建含無啟動(dòng)子uidA基因轉(zhuǎn)化載體時(shí)，有意識(shí)地在緊靠uidA位點(diǎn)上游插入內(nèi)含子序列，已知該序列有增強(qiáng)基因表達(dá)的效應(yīng)，此內(nèi)含子的插入，可增加那些被標(biāo)定的弱的內(nèi)源性啟動(dòng)子的檢出機(jī)會(huì)[8]。

3 結(jié)論

通過研究外源uidA基因在體內(nèi)表達(dá)的時(shí)空特異性，利用PCR、GUS組織化學(xué)檢測等技術(shù)，從以tritordeum為受體、經(jīng)無啟動(dòng)子uidA轉(zhuǎn)化策略得到的轉(zhuǎn)基因供試材料中成功篩選出了外源uidA基因在花藥原基特異表達(dá)的單株。本研究結(jié)果表明，在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，無啟動(dòng)子的uidA插入到tritordeum某一內(nèi)源性調(diào)控序列的后面，能夠引起uidA的表達(dá)，并且表達(dá)部位僅限于花藥原基部位。可以確定，該序列是花藥原基特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子。

應(yīng)用無啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化策略，為標(biāo)定內(nèi)源性啟動(dòng)子提供了一種有效的手段，有著廣闊的應(yīng)用前景。

[1] 朱亞蘭,姚偉，竇建華，等.種子特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆分析及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2007,22(2):6-10.

[2] 張曉國,劉玉樂，康良儀，等.水稻花藥特異表達(dá)基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增及克隆[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1997,43(4):480-484.

[3] 彭仁旺,周雪榮，周奕華，等.煙草花藥特異表達(dá)基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析[J].生物工程學(xué)報(bào),1996,12(3):247-250.

[4] 何光源,吳旭乾，涂知明，等.轉(zhuǎn)基因tritordeum的遺傳分析[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,33(8):94-96.

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[6] Springer P S.Gene traps:Tools for plant development and genomics[J].The Plant Cell，2000，12(7)：1007-1020.

[7] Kertbundit S，de Greve H，Deboeck F，et al.Invivorandomβ-glucuronidase gene fusions inArabidopsisthaliana[J].Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(12)：5212-5216.

[8] McFadden E S，Sears E R.The origin ofTriticumspeltaand its free-threshing hexaploid relatives[J].J Hered，1946，37(3)：81-89.