顯色底物大豆磷脂酰肌醇的分離純化與檢測方法研究進(jìn)展

吳清平，李 琳,2,3，張菊梅，郭偉鵬

(1.廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,廣東 廣州 510070；2.中國科學(xué)院廣州化學(xué)研究所,廣東 廣州 510301；3.中國科學(xué)院研究生院,北京 100049)

隨著人們對(duì)食品安全問題的日益關(guān)注，簡便、快速、高效的檢測手段已成為目前微生物食品安全檢測的研究熱點(diǎn)。磷脂酰肌醇(Phosphtidylinositol，PI)作為常見食源性致病菌中的單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)特異性顯色培養(yǎng)基底物，可與LM中特有的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(Phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)發(fā)生特異性反應(yīng)[1],在LM顯色培養(yǎng)基上形成不透明的白色暈圈，從而達(dá)到特異性檢測LM的目的。顯色培養(yǎng)基技術(shù)解決了傳統(tǒng)檢測手段耗時(shí)長、特異性低、操作繁瑣等缺陷，具有可觀的應(yīng)用價(jià)值。

由于大豆中含有豐富的PI，且原料易得、成本低廉，因此，分離純化大豆磷脂酰肌醇對(duì)于其生物機(jī)理研究及其微生物安全檢測意義重大。鑒于此，作者綜述了大豆磷脂酰肌醇的分離純化與檢測方法研究進(jìn)展，并介紹了其在LM顯色培養(yǎng)基方面的重要應(yīng)用。

1 PI的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

1.1 結(jié)構(gòu)

PI是一種甘油磷脂，具有甘油磷脂的通性，不同生物體內(nèi)的PI因甘油所連接脂肪酸鏈的不同而具有不同的結(jié)構(gòu)。PI分子含有甘油、磷酸、脂肪酸及肌醇，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

虛線A1、A2、C、D分別為磷脂酶A1、A2、C、D的酶解部位

其中R1、R2為脂肪酸，常見的有軟脂酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油酸、花生四烯酸等，α位(R1CO-)的脂肪酸一般是飽和脂肪酸，而β位(R2CO-)的脂肪酸常為不飽和脂肪酸[2]。

PI所含的肌醇都是myo-肌醇，myo-肌醇是肌醇的一種異構(gòu)體，是由6個(gè)碳原子組成的環(huán)己六醇，C1,2,3,5上連接的羥基位于肌醇分子平面的一方，C4,6上連接的羥基位于另一方；C5和C2是對(duì)稱碳原子[3]，而C1和C3、C2和C6分別具有手性關(guān)系[4]，游離狀態(tài)的肌醇分子為內(nèi)消旋分子。在PI分子中，被磷酸取代而衍生出的具有旋光性的手性分子，除生物體內(nèi)C1位取代的L-myo-肌醇-l-磷酸是L型外，其余都是D型分子。

1.2 理化性質(zhì)

PI的純凈物為白色蠟狀固體，其中含有的不飽和脂肪酸在空氣中易被氧化而變成黃褐色或黑色。PI通常以鈉鹽的形式存在，為白色晶體，且易潮解和氧化。PI的熔點(diǎn)約為60 ℃，不耐高溫，100 ℃以上會(huì)發(fā)生氧化分解反應(yīng)[5]，280 ℃時(shí)會(huì)生成黑色的沉淀。PI可以與碘酸發(fā)生氧化反應(yīng)而生成醛類。PI與Schiff試劑反應(yīng)生成紫紅色化合物，可作為區(qū)別于其它磷脂的特性反應(yīng)。

PI易溶于氯仿、正己烷、乙醚、甲苯，微溶于甲醇、石油醚，不溶于丙酮、乙醇。PI在弱堿性溶液中的溶解度較大。由于磷脂類分子既含有親水性的磷酸酯基，又含有疏水性的脂肪烴基，因此，可作為兩性表面活性劑包裹在油滴的表面，大幅降低油水間的界面張力，從而形成均勻穩(wěn)定的乳化液。

從結(jié)構(gòu)上看，PI具有脂肪酸、酯鍵、烷基以及肌醇上的取代基，可發(fā)生特異性化學(xué)反應(yīng)，如水解反應(yīng)、加成反應(yīng)、氧化反應(yīng)、乙?；磻?yīng)、羥基化反應(yīng)、硫酸化反應(yīng)及絡(luò)合反應(yīng)等[6]。

2 PI的分離純化方法

大豆磷脂中的主要成分為PI、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)，通常利用它們之間極性的差異進(jìn)行分離。目前常用的分離方法主要有柱層析法、溶劑萃取法、酶法等。

2.1 柱層析法

用于分離PI的柱層析法主要有硅膠柱層析、離子交換柱層析以及氧化鋁柱層析等，常用的溶劑主要有氯仿和低級(jí)醇等溶劑混合物。采用梯度洗脫的方法可以提高PI純度，也可采用低壓制備色譜柱在等度洗脫條件下分離，得到純度高達(dá)90%以上的PI。

宋華等[7]采用100 mm×26 mm色譜柱，以氯仿-甲醇(2∶1，體積比，下同)為流動(dòng)相，在流速為3.0 mL·min-1的條件下分離，PI純度達(dá)到90%以上、PE純度80%以上、PC純度95%以上。姜波等[8]以氯仿-甲醇(1.8∶1)為流動(dòng)相，在上樣量為1.0 g·(100 g)-1的條件下得到的PI純度可達(dá)91.5%。

將混合磷脂溶解在CHCl3-CH3OH(1∶1)中，經(jīng)Al2O3柱層析洗脫，得到含有PC、糖脂以及溶血磷脂的混合液，繼續(xù)用CHCl3-1% CH3OH-COONH4(1∶1∶0.3)溶液洗提，再用硅膠柱層析分離，可得到高純度的PI。另外，先加入洗脫液CHCl3得到中性脂質(zhì)，再加入CHCl3-CH3OH(4∶1)洗脫糖脂和部分PE，最后加入CHCl3-CH3OH-25%NH3(80∶20∶5或65∶25∶5)洗提PI，蒸發(fā)干燥，PI純度達(dá)98%～99%[9]。

2.2 溶劑萃取法

溶劑萃取法是根據(jù)所分離組分在不同有機(jī)溶劑中溶解性的差異來進(jìn)行分離的。常用的溶劑有甲醇、丙酮、正己烷、異丙醇、三氯甲烷及其混合溶劑等。溶劑萃取法技術(shù)成熟、操作簡便、溶劑能回收利用、容易放大且能連續(xù)化生產(chǎn)，是傳統(tǒng)的分離PI的方法之一。

陳志強(qiáng)等[10]采用乙醇和正己烷萃取大豆PI，效果較佳。吳平等[11]進(jìn)一步對(duì)分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，PI的純度從26%提高到73.89%。

溶劑萃取法結(jié)合柱層析法可以顯著提高PI的產(chǎn)率。柳葉[12]在溶劑萃取法分離PI的基礎(chǔ)上，將醇溶液用Al2O3處理，以甲醇-氨水(20∶1)為洗脫劑，PE的洗脫率達(dá)到32.3%。劉代成等[13]首先用堿性乙醇抽提去除混合大豆磷脂中的PE和PC；將得到的粗品溶于非極性溶劑中，加入含堿性物質(zhì)的極性溶劑，調(diào)pH值至8.0～10.0；液液萃取后，再加入金屬鹽純化，PI純度可達(dá)87.8%。

將溶劑萃取法與一些化學(xué)反應(yīng)相結(jié)合可得更高純度的PI。如將混合磷脂溶在有機(jī)溶劑(如無水吡啶、乙腈、DMF、DMSO)中，加入氯化三甲基硅、氯化二甲基叔丁基硅或烯丙基溴保護(hù)羥基，再用丙酮或乙醇將產(chǎn)物從反應(yīng)體系中萃取出來，加入酸性物質(zhì)水解，去除保護(hù)基團(tuán)，恢復(fù)羥基，PI純度可達(dá)98%以上。

2.3 酶法

目前發(fā)現(xiàn)的主要有4種磷脂酶，即磷脂酶A1、A2、C和D，它們可以水解不同的酯鍵(見圖1)。

磷脂酶D作用于混合磷脂中，可以水解去除含氨基團(tuán)，在特定條件下，能催化各種含羥基底物結(jié)合到磷脂的堿基上，從而形成新的磷脂，這一特性稱為磷脂酶D的磷脂轉(zhuǎn)移特性[14](Transphosphatidylation)或堿基交換反應(yīng)(Base exchange reaction)。Nakazato在磷脂酶D存在下得到純度為70%的PI[15];McGuigan[16]在醇和肌醇存在下制備PI；Juneja等[17]在L-或D-絲氨酸存在下，將PC轉(zhuǎn)化為磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)，轉(zhuǎn)化率分別為98.5%和100%。

由于磷脂酶D不會(huì)水解PI，而是選擇性地水解其它的磷脂成分(如PC和PE)，因此，將乙醇處理后的混合磷脂(含少量的PC)用磷脂酶D處理，然后用堿性或酸性磷脂酶處理，PI的純度可達(dá)60%～70%[18]。

3 PI的檢測方法

3.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法分離混合磷脂常用的固定相為硅膠；常用的流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水體系和正己烷-異丙醇-水體系[19,20]；檢測器一般采用紫外檢測，在205 nm處有較強(qiáng)吸收。

大豆磷脂中主要組分PC、PE以及PI的測定可依照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21493-2008進(jìn)行。采用Si-60色譜柱(250 mm×2.6 mm)，填充物粒度5 μm，以正己烷-異丙醇-1%冰醋酸(8∶8∶1)為流動(dòng)相，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，采用梯度洗脫可達(dá)到更好的分離效果。

3.2 薄層層析法

郭勃等[21]采用10 cm×10 cm、10 cm×20 cm薄層展開板，采用雙向展開劑[展開劑A：氯仿-甲醇-冰醋酸-丙酮-水(35∶25∶4∶14∶2)，展開劑B：正己烷-乙醚(4∶1)]，用磷鉬酸乙醇溶液(5%～10%)或Dittmer試劑顯色對(duì)PI進(jìn)行檢測。

商宗一等[22]將溶有PI的有機(jī)提取液通過2根陰陽離子交換樹脂分離柱后，再用氯仿-甲醇洗脫來分離PI。

3.3 其它檢測方法

利用超臨界色譜(SFC)[23]對(duì)PI進(jìn)行分離。采用Spherisorb C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，不銹鋼柱)，流動(dòng)相為CO2改性劑(10∶1)，流速1.1～1.3 mL·min-1，柱溫30～60 ℃，壓力20 MPa，檢測波長214 nm，用外標(biāo)峰面積定量法測定PI含量[24]，不僅分離效率高，且環(huán)保無污染，是一種理想的分離手段，但由于成本及技術(shù)要求高尚未得到廣泛應(yīng)用。

20世紀(jì)90年代后發(fā)展成熟的磷原子核磁共振效應(yīng)可用于分析各磷脂組分的含量，Thomas用30 mL甲醇-氯仿溶解，再用0.2 mol EDTA沉淀金屬離子，在202.4 MHz下用核磁共振分析了富集PI的磷脂組分，PI的31PNMR的化學(xué)位移為-0.37 ppm[25]。

4 PI在LM顯色培養(yǎng)基方面的應(yīng)用

近年來顯色培養(yǎng)基方法[26]相對(duì)于傳統(tǒng)檢測方法省時(shí)省力且準(zhǔn)確度高、操作簡便，得到了普遍認(rèn)可和越來越廣泛的應(yīng)用。

目前應(yīng)用最廣泛的CHROMagar Listeria顯色培養(yǎng)基、ALOA培養(yǎng)基以及OCLA培養(yǎng)基[27]等都是以PI和5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃糖苷為底物進(jìn)行檢測的。而國內(nèi)對(duì)PI作為底物的研究及應(yīng)用鮮有報(bào)道。

作者所在研究團(tuán)隊(duì)近年來對(duì)常見食源性致病菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行了深入研究，已成功研制出一系列特異性顯色培養(yǎng)基并已經(jīng)得到商品化應(yīng)用。為了進(jìn)一步提高顯色培養(yǎng)基的檢測效果并降低底物成本，進(jìn)行了顯色底物的自主合成研究，其中結(jié)合溶劑萃取和柱層析分離的PI純度達(dá)97%以上，與進(jìn)口PI產(chǎn)品的顯色效果無明顯差異。目前，正開發(fā)特異性更高的底物以及使用多種復(fù)合底物，以進(jìn)一步提高包括LM在內(nèi)的特異性底物顯色培養(yǎng)基的檢測特異性和靈敏度。

5 結(jié)語

由于大豆磷脂中含有性質(zhì)相似的多種磷脂類物質(zhì)，包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)等，且市售的混合磷脂中PI的含量一般只有10%左右，不能直接應(yīng)用到顯色培養(yǎng)基中；同時(shí)大豆磷脂原料中的幾種組成成分都具有磷脂類化合物的通性且結(jié)構(gòu)具有相似部分，因此，采用常規(guī)方法難以得到純度較高的單一磷脂；另外，磷脂類化合物PI含有的肌醇結(jié)構(gòu)以及不飽和脂肪鍵等使其具有容易氧化、不耐高溫等缺點(diǎn)，在分離制備過程中容易變性，從而更增加了分離難度。

溶劑法具有操作簡便、便于工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)，但是溶劑消耗量大、生產(chǎn)成本高；柱層析法分離效率高，但負(fù)載量小、可重復(fù)性差；高效液相色譜法雖可制備少量PI純品，但成本較高、操作復(fù)雜、產(chǎn)量很少，還停留在實(shí)驗(yàn)室少量分析階段。因此尋找可行的高效分離手段成為目前亟待解決的問題。

國內(nèi)LM顯色底物制備方面的研究相對(duì)落后，直接制約了其在LM檢測顯色培養(yǎng)基方面的應(yīng)用。隨著研究的深入，將兩種以上的分離方法相結(jié)合來提高分離純度及酶解法制備PI均具有一定的發(fā)展?jié)摿?。隨著PI需求的增加，開發(fā)簡便可行的高純度制備工藝將成為未來研究的發(fā)展方向。

[1] Aurora R，Prakash A，Prakash S，et al.Comparison of PI-PLC bas-ed assays and PCR along withinvivopathogenicity tests for rapid detection of pathogenicListeriamonocytogenes[J].Food Control，2008，19(7)：641-647.

[2] Gerelli Y，Di Bari M T，Deriu A，et al.Structure and organization of phospholipid/polysaccharide nanoparticles[J].Journal of Physics:Condensed Matter，2008，20(10)：104-211.

[3] de Meyer F,Smit B.Effect of cholesterol on the structure of a phospholipid bilayer[J].PNAS,2009，106(10)：3654-3658.

[4] Anderson R J,Groundwater P W,Huang Y,et al.Synthesis and evaluation of novel chromogenic peptidase substrates based on 9-(4′-aminophenyl)-10-methylacridinium salts as diagnostic tools in clinical bacteriology[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2008，18(2)：832-835.

[6] Liu Y C,Mihai C,Kubiak R J,et al.Phosphorothiolate analogues of phosphatidylinositols as assay substrates for phospholipase C[J].ChemBioChem，2007，8(12)：1430-1439.

[7] 宋華，陳福明.柱層析法分離大豆磷脂[J].中國油脂，2005，30(2)：41-43.

[8] 姜波，胡志雄，張維農(nóng),等.柱色譜法制備高純大豆肌醇磷脂研究[J].糧油加工，2009，(7)：77-80.

[9] 鄧啟剛，齊樂，安紅.大豆肌醇磷脂的分離技術(shù)研究[J].化學(xué)工程師，2003，(6)：14-16.

[10] 陳志強(qiáng)，安紅，何錫鳳.溶劑法分離制備大豆肌醇磷脂[J].齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(2)：1-4.

[11] 吳平，安紅，何錫鳳，等.大豆肌醇磷脂制備優(yōu)化條件的研究[J].中國油脂，2006，31(6)：87-89.

[12] 柳葉.氧化鋁柱層析分離純化磷脂的工藝優(yōu)化[D].杭州：浙江大學(xué)，2006.

[13] 劉代成，安立國，陶務(wù)端，等.高純度磷脂酰肌醇的制備方法[P].CN 1 560 057,2005-01-05.

[14] Shashidhar M S，Volwerk J J，Griffith O H,et al.A chromogenic substrate for phosphatidylinositol-specific phospholipase C：4-Nitrophenyl myo-inositol-1-phosphate[J].Chemistry and Physics of Lipids，1991，60(2)：101-110.

[15] Row K H，Kang D H.Normal-phase high-performance liquid ch-romatography of phospholipids from soybean with evaporative light scattering detection[J].American Biotechnology Laboartory，2003,21(9):40-42.

[16] McGuigan C.A new and rapid synthesis of phospholipids[J].J Chem Soc Chem Commun，1986,(7):533-534.

[17] Juneja L R,Kazuoka T,Goto N,et al.Studies on the enzymic conversion of phospholipids(Ⅵ).Conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylserine by various phospholipase D in the presence of L- or D-serine[J].Biochem Biophys Acta(BBA)-Lipids and Lipid Metabolism，1989，1003(3)：277-283.

[18] Van der Meeren P，Vanderdeelen J，Huys M，et al.Simple and ra-pid method for high-performance liquid chromatographic separation and quantification of soybean phospholipids[J].J Chromatogr A，1988，447(2):436-442.

[19] Olsson P，Holmb?ck J，Hersl?f B.Separation of lipid classes by HPLC on a cyanopropyl column[J].Lipids，2012，47(1)：93-99.

[20] Chen C B，Yang L Q，Zhou J.Trace bensulfuron-methyl analysis in tap water，soil，and soybean samples by a combination of molecularly imprinted stir bar sorption extraction and HPLC-UV[J].Journal of Applied Polymer Science，2011，122(2)：1198-1205.

[21] 郭勃，徐桂云，常理文.大豆磷脂組成的薄層色譜分析[J].分析化學(xué)，1998，26(1)：81-84.

[22] 商宗一，張金紅.樹脂法分離純化植物磷脂酰肌醇的新工藝[P].CN 86 101 623，1987-09-23.

[23] 陽東升,陳良才，劉根凡，等.用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)制備蛋黃卵磷脂的幾種工藝探討[J].現(xiàn)代化工，2003，23(10)：46-53.

[24] Wadud S，Leon-Velarde C G,Larson N,et al.Evaluation of immunomagnetic separation in combination with ALOAListeriachromogenic agar for the isolation and identification ofListeriamonocytogenesin ready-to-eat foods[J].Journal of Microbiological Methods,2010，81(2)：153-159.

[25] 王學(xué)軍，趙鎖奇，王仁安.超臨界流體色譜法分析大豆磷脂[J].色譜，2001，19(4)：344-346.

[26] Aragonalegro L，Aragon D,Martinez E,et al.Performance of a chromogenic medium for the isolation ofListeriamonocytogenesin food[J].Food Control,2008，19(5)：483-486.

[27] Becker B，Schuler S，Lohneis M,et al.Comparison of two chromogenic media for the detection ofListeriamonocytogeneswith the plating media recommended by EN/DIN 11290-1[J].International Journal of Food Microbiology，2006，109(1-2)：127-131.