正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選清肺平喘顆粒的提取工藝

李玉平，張 利，黎曉敏*

（1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市獸藥工程技術(shù)研究中心，重慶 400716）

近年來，畜禽生產(chǎn)中越來越多的疾病都伴隨氣喘的癥狀，氣喘可引起畜禽的抵抗力下降，從而引發(fā)多種疾病，同時(shí)使生產(chǎn)性能下降，經(jīng)濟(jì)效益降低，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。為了減少化學(xué)藥物的藥物殘留，保障食品安全，應(yīng)該加強(qiáng)對中獸藥制劑的研發(fā)和應(yīng)用。目前，我國中獸藥制劑工藝比較落后，大多數(shù)成方制劑仍以散劑為主，有效成分不能合理應(yīng)用。顆粒劑既能夠保持中醫(yī)藥的傳統(tǒng)用藥特色，又能最大限度地提取和保留處方中藥物的有效成分，發(fā)揮有效成分的綜合治療作用，確保臨床療效。同時(shí)，顆粒劑性質(zhì)穩(wěn)定，服用、攜帶、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸均較方便。

清肺平喘顆粒的方劑由板藍(lán)根、浙貝母、甘草、葶藶子、桔梗組成，具有清肺平喘，止咳化痰的功效[1]。為了發(fā)揮藥物的最佳療效，也便于生產(chǎn)中的臨床給藥，進(jìn)而優(yōu)化制備工藝。試驗(yàn)對組方進(jìn)行分析，根據(jù)各味藥材所含成分的性質(zhì)，擬分水溶和醇溶兩組提取。本試驗(yàn)以甘草酸和貝母素甲的含量及其所得浸膏率為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對各自提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋由金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀由德國海道夫公司生產(chǎn)，Waters高效液相色譜儀、蒸發(fā)光散射檢測器、紫外檢測器由美國Waters公司生產(chǎn)，KQ-600DA數(shù)控超聲波清洗器型由昆山市超生儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 試劑

貝母素甲、甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純；藥材均購自重慶市桐君閣大藥房，經(jīng)鑒定均符合2010年版《中國獸藥典（一部）》規(guī)定。

2 試驗(yàn)方法

2.1 醇提工藝條件的研究

2.1.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)浙貝母、葶藶子、桔梗所含成分的性質(zhì)及參考有關(guān)文獻(xiàn)，確定乙醇用量（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇濃度（C）、提取次數(shù)（D）4個(gè)因素，選擇3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)考察，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L9（34）表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 醇提法因素水平

2.1.2 提取方法

按照處方比例稱取浙貝母、葶藶子、桔梗藥材各9份，按正交表設(shè)計(jì)進(jìn)行提取，合并提取液，過濾，60℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至50 mL，作為貯備液。以貝母素甲的含量和出膏率作為指標(biāo)進(jìn)行直觀分析和方差分析，優(yōu)化醇提工藝。

2.1.3 浸膏得率的測定

精密吸取提取液25 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，105℃干燥3 h，取出，置干燥器內(nèi)冷卻30 min，精密稱重，計(jì)算出膏率。

2.1.4 貝母素甲的含量測定

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水-二乙胺（70∶30∶0.3）為流動(dòng)相，蒸發(fā)光散射檢測器。理論板數(shù)按貝母素甲峰計(jì)算應(yīng)≥2 000。蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)：漂移管溫度為85.5℃，載氣流速為2.2 L·min-1。流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃。

對照品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取貝母素甲對照品2.0 mg，甲醇溶解，定容至10 mL，得到濃度為0.2 mg·mL-1對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密量取對照品溶液約5 mL，置燒瓶中，加濃氨溶液1 mL浸潤1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）的混合溶液10 mL，稱重，混勻，置80℃水浴中加熱回流2 h，放冷，再稱重，加對照品溶液補(bǔ)足減失的重量，過濾。將續(xù)濾液置蒸發(fā)皿中蒸干（60℃），用甲醇定容至2 mL，搖勻，即得供試品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取貝母素甲對照品10.20 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即制成含貝母素甲1.02 mg·mL-1。分別吸取溶液0.2、0.4、0.8、1.6、3.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇配制成系列濃度溶液。精密吸取各溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積[2-4]。以峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(biāo)，貝母素甲進(jìn)樣量的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)，作直線回歸，得回歸方程為：Y=1.3663X+8.1504，r=0.9996，結(jié)果表明，貝母素甲含量為0.204～3.06 μg，線性關(guān)系良好。

含量測定：精密吸取對照品溶液和樣品溶液各10 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，測定。

2.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3份樣品，采用加醇量12倍、80%的乙醇濃度進(jìn)行提取，時(shí)間為1.5 h，提取2次，測定貝母素甲的含量。

2.2 水提工藝條件的研究

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將上述醇提取后的藥物殘?jiān)桶逅{(lán)根、甘草水煎提取，確定加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）3個(gè)因素，選擇了3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)考察，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L9（34）表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表2。

圖1 貝母素甲對照品溶液HPLC結(jié)果

表2 水煎煮法因素水平

2.2.2 提取方法

按照處方比例稱取板藍(lán)根和甘草藥材共9份，按正交表設(shè)計(jì)進(jìn)行提取，合并提取液，濾過，60℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至50 mL，作為貯備液。以甘草酸含量和出膏率作為指標(biāo)進(jìn)行直觀分析，優(yōu)化水提工藝。

2.2.3 浸膏得率的測定

精密吸取提取液25 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，105℃干燥3 h，取出，置干燥器內(nèi)冷卻30 min，精密稱重，計(jì)算出膏率。

2.2.4 甘草酸的含量測定

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨溶液-冰醋酸（66∶33∶1）為流動(dòng)相；檢測波長為250 nm。理論板數(shù)按甘草酸峰計(jì)算應(yīng)≥2 000。

對照品溶液的制備：精密稱取甘草酸銨對照品約1.0 mg，置25 mL容量瓶中，流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，即得（每1 mL含甘草酸單銨鹽對照品40 μg，折合甘草酸為39.18 μg）。

供試品溶液的制備：精密量取貯備液約2 mL，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，超聲處理（功率100 W，頻率20 kHz）60 min，取出，放冷，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取甘草酸銨適量，置25 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，配制濃度為80.0 μg·mL-1的對照品溶液。分別吸取貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，按上述色譜條件，分別依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，測定峰面積[5-7]。對峰面積（Y）對其濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=8538.4X－4395.7,r=0.99994。結(jié)果表明，甘草酸含量為7.84～78.36 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

含量測定：精密吸取對照品溶液和樣品溶液各10 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，測定。

圖2 甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品HPLC結(jié)果

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3份樣品，加水量10倍進(jìn)行煎煮，時(shí)間為1.5 h，提取2次，測定甘草酸含量。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 醇提法提取工藝結(jié)果

醇提法提取工藝結(jié)果見表3～5。

表3 醇提法提取工藝正交實(shí)驗(yàn)

表4 醇提法浸膏得率方差分析

表5 醇提法貝母素甲含量方差分析

從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，對浸膏得率影響大小依次為D＞A＞B＞C，直觀分析結(jié)果表明最佳提取工藝為A3B2C1D3；對貝母素甲含量的影響主次順序?yàn)镈＞C＞A＞B，直觀分析結(jié)果表明最佳提取工藝為A3B2C3D2;方差分析結(jié)果來看，提取次數(shù)對干膏得率和貝母素含量的影響顯著，加醇量和提取時(shí)間對浸膏得率有影響，提取濃度對含量影響顯著。從實(shí)際出發(fā)，綜合分析，選擇的最佳提取工藝為A3B1C3D2，即為加醇量12倍，提取1.5 h，乙醇濃度為80%，提取2次。

3.2 醇提取法驗(yàn)證試驗(yàn)

出膏率分別為14.5%、15.0%和14.2%，貝母素甲含量為 50.5、47.7、45.6 μg·mL-1，則進(jìn)一步證明，該工藝穩(wěn)定、可行，可作為最佳提取工藝。

3.3 水提法提取工藝結(jié)果

水提法提取工藝結(jié)果見表6～8。

表6 水提法正交實(shí)驗(yàn)

表7 水提法浸膏得率方差分析

表8 水提法甘草酸含量方差分析

由表6～8可知，對浸膏得率影響順序?yàn)镃＞B＞A，直觀分析結(jié)果表明最佳提取工藝為A1B3C3；3個(gè)因素中，提取次數(shù)對浸膏得率有顯著影響；對甘草酸含量的影響主次順序?yàn)镃＞A＞B，3個(gè)因素對甘草酸含量影響都不顯著；直觀分析結(jié)果表明，最佳提取工藝為A2B2C3；從實(shí)際出發(fā)，綜合分析選擇的最佳提取工藝為A2B3C3，即加水量10倍，提取1.5 h，提取3次。

3.4 水提法驗(yàn)證試驗(yàn)

出膏率為26.40%、24.88%和26.24%，甘草酸含量為31.42、30.62和32.42 ug·mL-1。結(jié)果進(jìn)一步證明，該工藝穩(wěn)定、可行，可作為最佳提取工藝。

4 討論

中獸藥在治療哮喘方面有獨(dú)特的優(yōu)勢，其具有作用靶點(diǎn)多、副作用小、療效確切等優(yōu)點(diǎn)。目前，大多數(shù)中獸藥制劑多以散劑為主，制作粗糙，服用量大，不利于畜禽的吸收，而制成顆粒劑，使起主要作用的有效成分濃度增高，進(jìn)而增強(qiáng)了其藥效；溶解釋放迅速、起效快，便于動(dòng)物吸收；給藥途徑上，顆粒劑既可飲水，也可混飼，克服了中獸藥散劑必須通過混飼的方式給藥的缺陷；顆粒劑中添加了矯味劑，克服了某些中藥的苦味，口感好，動(dòng)物服用方便；顆粒劑性質(zhì)穩(wěn)定，質(zhì)量可控，適于工業(yè)化生產(chǎn)；制成顆粒劑后，體積重量遠(yuǎn)比散劑小的多，服用、攜帶、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸均較方便。

清肺平喘顆粒為復(fù)方制劑，成分復(fù)雜。提取時(shí)需根據(jù)處方中各藥材多含有效成分的性質(zhì)進(jìn)行選擇。浙貝母主要有效成分是貝母素甲、貝母素乙等甾體生物堿，在乙醇中的溶解度大。而葶藶子主要含槲皮素、山奈酚等，為基本苷元的黃酮苷類成分，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑。桔梗的主要活性成分桔梗皂苷也易溶于乙醇，同時(shí)有關(guān)研究表明，采用醇提法提取效率高，故采用乙醇回流提取[8-9]。甘草所含有效成分甘草酸、甘草次酸等水溶性強(qiáng)，有報(bào)道指出，將甘草和板藍(lán)根同以上藥渣共水煎煮進(jìn)行提取可提高提取率[10-11]。

正交實(shí)驗(yàn)中有效成分含量的選擇需根據(jù)藥材中止咳平喘藥效較強(qiáng)的主要活性成分以及藥典中含量測定方法的標(biāo)準(zhǔn)來確定，故選擇貝母素甲、甘草酸的含量作為評價(jià)的指標(biāo)。但是復(fù)方中成分復(fù)雜，僅僅靠單指標(biāo)評價(jià)有一定的局限性，故選擇出膏率和有效成分的含量共同作為評價(jià)指標(biāo)，可綜合評價(jià)工藝的合理性。

5 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳醇提工藝為：濃度為80%乙醇、12倍的量，提取2次，每次提取1.5 h。最佳水提工藝為：加水量10倍，提取1.5 h，提取3次；經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，出膏率和含量均較高，穩(wěn)定性好，工藝可行。

[1]2010版中華人民共和國獸藥典二部第一版[M].中國農(nóng)業(yè)出版社,2011.

[2]孫國英,殷米來,李秋怡,等.浙貝母藥材中貝母素甲含量的測定方法比較研究[J].中國現(xiàn)代中藥,2008,10（10）:31-33.

[3]馬衛(wèi)成,戎建輝,盛振華,等.浙貝母的高效液相色譜特征圖譜研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2008,28（17）:1 458-1 460.

[4]曾榮香,劉麗麗,陳麗華,等.HPLC-ELSD法測定不同來源浙貝母中貝母素甲的含量的研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,21（5）:51-52.

[5]許楊彪,黃小歐.高效液相色譜法測定健胃茶中甘草酸含量[J].中國藥房,2006,17（6）:462-463.

[6]劉忠,張洪濤,蔡俊安,等.高效液相色譜法測定肝康顆粒中甘草酸含量[J].藥物鑒定,2009,18（21）:38-39.

[7]宋九華,李瓊,萬東海.HPLC測定九味羌活丸中甘草酸的含量[J].樂山師范學(xué)院學(xué)報(bào),2010,25（5）:43-44.

[8]戴國友,劉志輝,陳曉斌,等.不同溶媒對浙貝母生物堿含量影響的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2001,12（9）:779-780.

[9]丁春霞,屠善軍,應(yīng)敏.浙貝母中生物堿提取方法以及條件的優(yōu)化[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2004,18（2）:28-30.

[10]姚衛(wèi)民,蘇根,陳選京.葶藶平喘栓制備工藝研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2003（5）:12-13.

[11]吳碧元,孫軍,蔣紅芳.桔梗提取工藝的研究[J].中藥材,2002,25（6）:430-432.