急性缺血性腎損傷大鼠VEGF表達(dá)與腎小管壞死評(píng)分的相關(guān)性研究▲

霍冬梅 伍巧源 馮 煒 張影華 廖蘊(yùn)華

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧市 530021)

急性腎損傷(AKI)是一種常見的臨床綜合征，其病死率很高。已發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腎臟疾病及糖尿病腎病腎組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)常有改變，并且參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。而在AKI時(shí)VEGF水平變化研究較少。本文在建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷(IRI)模型的基礎(chǔ)上，采用雙抗體夾心ELISA法和快速型免疫組化二步法檢測IRI術(shù)后不同時(shí)間段腎臟組織VEGF表達(dá)水平，并與腎功能、腎小管壞死等相關(guān)指標(biāo)做相關(guān)分析，以了解VEGF在腎臟IRI中的作用，為AKI發(fā)病機(jī)制以及治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 健康雄性 Wistar大鼠 60只，體重(268.9±8.94)g，隨 機(jī) 分 成 假 手 術(shù) 組、手 術(shù) 組 2 組(各30只)。兩組大鼠再分別隨機(jī)分成手術(shù)后5個(gè)不同時(shí)段亞組(6、12、24、48、72 h)，每個(gè)亞組6 只大鼠，各亞組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)參照J(rèn)orge等［1，2］的方法，每組大鼠均以水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后，經(jīng)背雙側(cè)肋弓下緣距脊柱約0.5 cm處行約長1.5 cm的縱行切口，鈍性分離并暴露雙側(cè)腎臟，各組處理分別如下，①手術(shù)組:小心分離雙側(cè)腎動(dòng)脈，用無創(chuàng)性動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈，雙側(cè)腎臟顏色先由鮮紅色變蒼白，然后轉(zhuǎn)為暗紅色，60 min后松夾恢復(fù)灌注，腎臟顏色再變成鮮紅色，確定腎臟恢復(fù)血流后逐層關(guān)腹并縫合切口，建立腎臟 IRI模型，術(shù)后大鼠自由攝食和飲水。②假手術(shù)組:暴露雙側(cè)腎臟后，覆蓋浸有生理鹽水的紗布，60 min后去除紗布后逐層關(guān)腹，縫合切口，術(shù)后大鼠自由攝食和飲水。

1.3 標(biāo)本采集及檢測

1.3.1 采血 術(shù)前每只大鼠采血，分別于手術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h將手術(shù)組和假手術(shù)組大鼠采血，血清送檢測血 BUN、Cr。

1.3.2 處置 取部分腎臟組織置于10%中性甲醛溶液固定，送病理科由專人負(fù)責(zé)常規(guī)石蠟包埋、切片及染色等操作。

1.3.3 光鏡觀察及腎小管壞死評(píng)分 腎組織常規(guī)切片做HE染色。用顯微鏡觀察腎組織學(xué)改變，病變嚴(yán)重處用400倍高倍鏡觀察，并取10個(gè)高倍鏡視野共100個(gè)腎小管，根據(jù)Paller氏法進(jìn)行腎小管評(píng)分［3］:腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平(1分);腎小管內(nèi)出現(xiàn)管型(2分);腎小管腔內(nèi)有脫落、壞死的細(xì)胞，但未成管型或細(xì)胞碎片(1分);上皮細(xì)胞顆粒變性(1分);空泡變性(1分);細(xì)胞核固縮(1分)。

1.3.4 腎組織VEGF的表達(dá) 使用快速型免疫組化二步法檢測腎臟組織VEGF表達(dá)。結(jié)果分析:①腎小球VEGF表達(dá)。閱片時(shí)計(jì)算平均每個(gè)腎小球橫切面中VEGF陽性細(xì)胞數(shù)目，以細(xì)胞/腎小球橫向聯(lián)合切面表示(VEGF+cells，gcs-1)，每張片計(jì)數(shù)10個(gè)以上腎小球。數(shù)據(jù)以s表示。②腎小管內(nèi)VEGF表達(dá)。200倍視野下隨機(jī)選取20個(gè)不同視野場，測定集合管VEGF陽性面積占視野面積的百分比，取均值作為衡量腎小管內(nèi)VEGF表達(dá)的指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所 有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，各組間樣本均數(shù)比較均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各指標(biāo)間的相互關(guān)系采用Pearson直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組手術(shù)前后腎功能檢測 ①各組不同時(shí)段術(shù)前血清BUN、sCr之間、假手術(shù)組術(shù)后與術(shù)前對(duì)比及假手術(shù)后不同時(shí)段間對(duì)比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②手術(shù)組血清BUN、Cr于術(shù)后6 h較術(shù)前及相應(yīng)時(shí)段假手術(shù)組對(duì)比已經(jīng)顯著升高，并隨時(shí)間延長逐漸升高，高峰期在術(shù)后48 h。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)段血清BUN、sCr變化

2.2 腎組織VEGF的表達(dá)

2.2.1 腎小球VEGF表達(dá) 各手術(shù)組腎小球VEGF表達(dá)在不同時(shí)間段間及與各假手術(shù)組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。顯微鏡下觀察比較術(shù)后6 h、12 h、24 h、72 h各組情況見圖1～圖10。

表2 各組大鼠不同時(shí)段腎小球VEGF表達(dá) (gcs-1)

2.2.2 腎小管內(nèi)VEGF表達(dá) ①假手術(shù)組各時(shí)段腎小管內(nèi)VEGF表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);②手術(shù)組腎小管VEGF表達(dá)于術(shù)后6 h較相應(yīng)時(shí)段假手術(shù)組顯著增多，于術(shù)后12 h達(dá)到最高，從術(shù)后24 h開始表達(dá)逐漸減少，并于術(shù)后72小時(shí)腎組織VEGF表達(dá)較假手術(shù)組無顯著差異。見表3。顯微鏡下兩組各時(shí)間段對(duì)比見圖1～圖10。

表3 各組大鼠不同時(shí)段腎小管內(nèi)VEGF表達(dá) ( s)

表3 各組大鼠不同時(shí)段腎小管內(nèi)VEGF表達(dá) ( s)

*vs假手術(shù)組P＜0.01;#vs前一時(shí)段手術(shù)組P＜0.01。

組別 n 術(shù)后時(shí)間(h)腎小管內(nèi)VEGF表達(dá)(%)假手術(shù)組6 6 15.0 ±0.53 6 12 14.9 ±0.61 6 24 14.9 ±0.0.85 6 48 15.0 ±0.80 6 72 15.0 ±0.23手術(shù)組 6 6 37.6 ±4.67*6 12 62.9 ±4.87*#6 24 41.8 ±2.03*#6 48 31.1 ±2.42*#6 72 14.0 ±0.96#

2.3 光鏡下腎小管壞死評(píng)分 ①各不同時(shí)段假手術(shù)組腎小管壞死評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);②手術(shù)組腎小管壞死評(píng)分于術(shù)后6 h與相應(yīng)時(shí)段假手術(shù)組對(duì)比已經(jīng)顯著升高 ，并隨時(shí)間延長而逐漸升高，高峰期在術(shù)后48 h(P ＜0.01)，見表4。

表4 各組大鼠不同時(shí)段腎小管壞死評(píng)分 ( s)

表4 各組大鼠不同時(shí)段腎小管壞死評(píng)分 ( s)

*vs假手術(shù)組P＜0.01;#vs前一時(shí)段手術(shù)組P＜0.01。

腎小管壞死評(píng)分假手術(shù)組組別 n 術(shù)后時(shí)間(h)15.3 ±0.56 6 12 14.8 ±0.75 6 24 15.3 ±0.82 6 48 15.2 ±0.75 6 72 14.5 ±1.05手術(shù)組 6 6 44.3 ±3.50*6 12 62.5 ±1.87*#6 24 97.3 ±1.63*#6 48 148.7 ±5.43*#6 72 122.5 ±3.78 6 6*

2.4 腎組織VEGF表達(dá)及與其他指標(biāo)的Pearson直線相關(guān)分析 腎小球內(nèi)VEGF表達(dá)與術(shù)后血BUN、Cr水平、腎小管壞死評(píng)分均無顯著相關(guān)性(P＞0.05);腎小管VEGF表達(dá)與術(shù)后血 BUN、Cr水平、腎小管壞死評(píng)分均呈正相關(guān)(P ＜0.05)。見表5。

表5 腎小管VEGF表達(dá)與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析

圖1 腎假手術(shù)6 h組腎組織VEGF少量表達(dá)(DAB染色，×400)

圖2 腎IRI 6 h組腎小管VEGF表達(dá)明顯增多(DAB染色，×400)

圖3 腎假手術(shù)12 h組腎組織VEGF少量表達(dá)(DAB染色，×400)

圖4 腎IRI 12 h組腎小管VEGF高度表達(dá)(DAB染色，×200)

圖5 腎假手術(shù)24 h組腎組織VEGF少量表達(dá)(DAB染色，×400)

圖6 腎IRI 24 h組腎小管VEGF表達(dá)增多(DAB染色，×200)

圖7 腎假手術(shù)48 h組腎組織VEGF少量表達(dá)(DAB染色，×400)

圖8 腎IRI 48 h組腎小管VEGF表達(dá)增多(DAB染色，×400)

圖9 腎假手術(shù)72 h組腎組織VEGF少量表達(dá)(DAB染色，×400)

圖10 腎IRI 72 h組腎小管VEGF表達(dá)無增多(DAB染色，×400)

3 討論

1989年Ferrara等［4］報(bào)道在牛垂體星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離并純化出血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)。此后許多研究表明，VEGF與受體結(jié)合后具有促新血管生長、增加血管通透性、維持血管作用、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞質(zhì)聚鈣作用、增加單核細(xì)胞趨化性并能活化蛋白酶等作用［5］。通過大量實(shí)驗(yàn)表明，缺血或缺氧是誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的最主要的因素。Bernaudin等［6］在對(duì)新生大鼠腦缺血缺氧的研究中亦發(fā)現(xiàn)有VEGF表達(dá)的明顯增多。本研究檢測腎IRI模型中腎組織VEGF的表達(dá)和腎功能、腎小管壞死評(píng)分變化，探討VEGF在腎臟IRI過程中的變化及可能的發(fā)病機(jī)制。

3.1 腎功能指標(biāo)的變化 國內(nèi)外文獻(xiàn)均顯示在腎臟IRI模型中血BUN、Cr均較假手術(shù)組明顯增高。本研究顯示大鼠腎臟IRI術(shù)后6 h血BUN、Cr已明顯增高，于手術(shù)后48 h達(dá)高峰，術(shù)后72 h開始回落。提示本研究腎臟IRI模型中腎功能損害最嚴(yán)重是在術(shù)后48 h。本研究以手術(shù)后6 h為始點(diǎn)，手術(shù)后6 h血BUN、Cr水平已顯著升高，但血BUN、Cr水平從手術(shù)后何時(shí)開始升高暫不清楚，有待進(jìn)一步研究觀察。

3.2 腎組織VEGF的表達(dá) 本研究顯示假手術(shù)組有少量腎小球內(nèi)VEGF表達(dá)及較普遍的腎小管內(nèi)VEGF表達(dá)，主要分布在外髄部腎小球和遠(yuǎn)端腎小管、集合管。本研究假手術(shù)組腎臟VEGF表達(dá)主要分布在外髄部的原因還不明確。根據(jù)腎臟外髄部供氧的特殊性［7］，這個(gè)區(qū)域的氧分壓較低，推測即使在不缺血的情況下這個(gè)區(qū)域上皮細(xì)胞亦可誘導(dǎo)VEGF的合成。本研究顯示腎小管內(nèi)VEGF表達(dá)于手術(shù)后6 h較假手術(shù)組顯著增多，術(shù)后12 h達(dá)高峰，后漸下降，于手術(shù)后72 h降至假手術(shù)組水平。腎小管表達(dá)增多的部位最早出現(xiàn)在外髄部、小葉間動(dòng)脈末梢附近腎小管，并隨灌注時(shí)間延長逐漸波及腎皮質(zhì)及其他部位。本研究腎小管內(nèi)VEGF表達(dá)于手術(shù)后12 h開始下降，推測可能因?yàn)閲?yán)重缺血缺氧導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞壞死增加、腎小管上皮細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量減少，使得腎小管分泌和表達(dá)VEGF減少。從以上結(jié)果，我們推測VEGF可能參與早期腎臟IRI的病理過程并扮演著重要的角色，但其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

3.3 光鏡腎小管壞死評(píng)分變化 本實(shí)驗(yàn)手術(shù)組腎小管壞死評(píng)分隨術(shù)后時(shí)間的延長逐漸增高，于手術(shù)后48 h達(dá)高峰，手術(shù)后72 h開始回落。腎小管壞死評(píng)分的過程支持腎小管損傷于腎臟IRI后48 h達(dá)最嚴(yán)重程度，而此時(shí)的血BUN、Cr水平亦達(dá)到高峰，說明腎小管壞死是腎IRI模型腎功能受損的主要因素。

3.4 腎組織VEGF表達(dá)與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析 為了進(jìn)一步探討腎組織VEGF的表達(dá)是否與腎臟IRI嚴(yán)重程度有關(guān)，以及其在該病變過程中的作用，本研究把腎組織VEGF表達(dá)水平與其他指標(biāo)做了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，腎小球VEGF表達(dá)與手術(shù)后血BUN、Cr水平和腎小管壞死評(píng)分呈正相關(guān)。隨著腎小管內(nèi)VEGF表達(dá)的升高，血BUN、Cr水平和腎小管壞死評(píng)分也逐漸升高。提示腎小管內(nèi)VEGF表達(dá)程度可以作為反映腎臟IRI損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

綜上所述，腎IRI模型中再灌注后腎功能、腎小管壞死評(píng)分均有不同程度的升高，高峰期均在手術(shù)后48 h，提示該模型在手術(shù)后48 h腎功能損害最嚴(yán)重;腎小管VEGF表達(dá)與IRI后血BUN、Cr水平和腎小管壞死評(píng)分呈正相關(guān)，提示腎小管VEGF表達(dá)的增高程度可以作為反映腎臟IRI嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

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