NOX4在高肺血流肺動(dòng)脈高壓大鼠中表達(dá)的意義▲

黃維佳 覃家錦 何 巍 戴 霞 馮 旭 郭建極 冼 磊

(1廣西柳州市人民醫(yī)院心胸外科，柳州市 545001;2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021)

NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激在許多心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。近年的研究發(fā)現(xiàn)，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧主要來(lái)源的NADPH氧化酶4(NOX4)，在缺氧性肺動(dòng)脈高壓、新生兒持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓(PPHN)的發(fā)病機(jī)制中有著重要的意義。但到目前為止，NOX4與左向右分流繼發(fā)的肺動(dòng)脈高壓是否有關(guān)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)建立左向右分流高肺血流肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，觀察大鼠肺組織中NOX4表達(dá)的變化，旨在初步探討NOX4在左向右分流型肺動(dòng)脈高壓病理機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，多通道生理記錄儀(RM-6000，日本)，GASTAT-mini血?dú)夥治鰞x(北京康美)，多通道 PCR儀(PERKINELMER，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別為分流11周組、分流8周組、分流4周組、對(duì)照組，每組10只，各分流組大鼠通過(guò)腹主動(dòng)脈－下腔靜脈分流法建立高肺血流肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，對(duì)照組常規(guī)開(kāi)腹但不建立分流，4組大鼠飼養(yǎng)條件相同。

1.3 建模方法 腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，手術(shù)切口選取腹部正中切口，鈍性游離后腹膜，暴露腹主動(dòng)脈及下腔靜脈，在腹主動(dòng)脈左腎動(dòng)脈開(kāi)口下方及髂總動(dòng)脈上方，分別用小動(dòng)脈夾夾閉，于腹主動(dòng)脈左側(cè)壁用尖刀片挑開(kāi)1 mm長(zhǎng)的切口，用20G套管針以45度角穿透腹主動(dòng)脈壁進(jìn)入相鄰的下腔靜脈內(nèi)，原則上不刺破下腔靜脈對(duì)側(cè)管壁，拔出針頭，用7-0滑線縫合腹主動(dòng)脈壁的切口，移走小動(dòng)脈夾，此時(shí)可觀察到大鼠下腔靜脈變粗，出現(xiàn)微弱搏動(dòng)，或顏色由暗變紅，均提示分流已形成。

1.4 平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)的測(cè)定 經(jīng)腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉，游離右頸外靜脈，將聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)右頸外靜脈插入大鼠肺動(dòng)脈，導(dǎo)管另一端接壓力換能器及多通道生理記錄儀，記錄mPAP。

1.5 分流量的檢測(cè) 按照齊建光等［1］介紹的方法，分別抽取大鼠肺動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和股靜脈血，應(yīng)用GASTAT-mini血?dú)夥治鰞x測(cè)定血氧飽和度，通過(guò)以下公式計(jì)算左向右分流量:左向右分流量=體動(dòng)脈血氧飽和度－股靜脈血氧飽和度)/(肺靜脈血氧飽和度－肺動(dòng)脈血氧飽和度)。若體動(dòng)脈血氧飽和度＞95%，肺靜脈血氧飽和度按100%估算，體動(dòng)脈血氧飽和度＜95%時(shí)，肺靜脈血氧飽和度則按98%估算。

1.6 右心室肥厚指數(shù)(RVI)測(cè)定 于大鼠心臟大血管根部切斷，取出心臟后分離右室游離壁(RV)、室間隔(S)及左室壁(LV)并分別稱(chēng)重，通過(guò)公式RVI=［RV/(LV+S)］計(jì)算右心室肥厚指數(shù)。

1.7 RT-PCR檢測(cè)肺組織5-HTT mRNA的表達(dá)

1.7.1 引物設(shè)計(jì) 通過(guò)NCB I基因數(shù)據(jù)庫(kù)查詢大鼠NOX4基因cDNA序列(GI:16758287)和內(nèi)參β-actin基因cDNA序列(GI:42475962)，大鼠 NOX4上游引物:5-TTCCGAGATTTACTACTGC-3;下游引物:5-TGTATCCCATCTGTTTGAC-3，產(chǎn)物大小374bp;β-actin上游引物:5-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3;下游引物:5-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3，產(chǎn)物大小 280 bp。

1.7.2 大鼠肺組織總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄聚合鏈反應(yīng)取大鼠肺組織100 mg加入1 mL RNA裂解液，剪碎后在冰浴條件下以12 000 rpm/min勻漿。肺組織總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄cDNA過(guò)程按試劑說(shuō)明書(shū)操作。PCR總反應(yīng)體系25 μL，94℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)行 PCR 熱循環(huán):94℃變性30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，最后 72℃再延伸 7 min。計(jì)算反應(yīng)體系中NOX4/β-actin反應(yīng)產(chǎn)物電泳條帶積分光密度(IOD)比值，以該值表示目的基因表達(dá)的相對(duì)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以mean±SD表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠平均肺動(dòng)脈壓力的變化 隨著建立模型時(shí)間的延長(zhǎng)，分流各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓逐步升高，分別為(20.9 ±2.2)mmHg(分流 4 周組)、(24.3 ±3.7)mmHg(分流8周組)、(31.2 ±5.5)mmHg(分流 11 周組)，其中分流11周組大鼠存在明顯肺動(dòng)脈高壓，與各組間指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組分流量的檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組左向右分流量為1.08±0.93，而分流11周組、分流8周組、分流4周組分流量分別為2.32 ±0.74、2.18 ±0.33、1.97 ±0.46，三者之間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。上述結(jié)果表明各分流組均出現(xiàn)了大量分流，通過(guò)腹主動(dòng)脈－下腔靜脈分流手術(shù)建立左向右分流肺動(dòng)脈高壓大鼠模型是成功的。

2.3 大鼠右心室肥厚指數(shù)的變化 隨著建立模型時(shí)間的延長(zhǎng)，分流各組大鼠右心室肥厚指數(shù)(RVI)逐步升高，分別為(35.3 ±4.9)%(分流 4 周組)、(39.6 ±8.3)%(分流8周組)、(49.2±6.8)%(分流11周組)，其中分流 11 周組的改變最為明顯，與各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.4 大鼠肺組織中 NOX4mRNA表達(dá)的情況 對(duì)照組、4周組、8周組、11周組大鼠肺組織中NOX4 mRNA表達(dá)水平分別 為 0.22 ± 0.05、0.27 ± 0.08、0.38 ± 0.11、0.62±0.07，表明隨著建立模型時(shí)間的延長(zhǎng)，分流各組大鼠肺組織中NOX4 mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)逐步升高的態(tài)勢(shì)，當(dāng)中11周組NOX4 mRNA的表達(dá)最明顯，與其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 4組大鼠肺組織中NOX4β-actin的顯示

圖2 4組大鼠肺組織NOX4 mRNA相對(duì)水平比較

3 討論

左向右分流型先天性心臟病合并肺動(dòng)脈高壓是臨床常見(jiàn)問(wèn)題，其嚴(yán)重的后果直接影響到外科手術(shù)的成功率和患者術(shù)后的生存質(zhì)量。因此，長(zhǎng)期以來(lái)先天性心臟病繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。研究認(rèn)為，肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷繼發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生機(jī)制中有重要的意義?；钚匝?ROS)分子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有直接的損傷作用，能引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，這些現(xiàn)象在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷造成動(dòng)脈粥樣硬化的研究中被證實(shí)。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)目前被認(rèn)為是血管內(nèi)皮中ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源［2］，他所產(chǎn)生的ROS與吞噬細(xì)胞中所產(chǎn)生的不同，主要作為第二信使參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)節(jié)，而不參與機(jī)體的細(xì)胞防御反應(yīng)。

有研究證明，NOX4與慢性缺氧性肺動(dòng)脈高壓及新生兒持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓(PPHN)的發(fā)生有關(guān)。Mittal等［3］對(duì)NADPH氧化酶的各亞單位在慢性缺氧小鼠肺組織中表達(dá)的情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NOX4在小鼠的肺部表達(dá)最為明顯，可能參與慢性缺氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷及肺血管平滑肌細(xì)胞的增生及慢性缺氧性肺動(dòng)脈高壓的形成。學(xué)者們?cè)诼匀毖鯇?dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的其他動(dòng)物模型中，也發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶所產(chǎn)生的活性氧能直接導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，造成肺血管重構(gòu)［4～7］。另外，Brennan 等［8］通過(guò)胎羊?qū)π律鷥撼掷m(xù)性肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制進(jìn)行研究，干預(yù)因素引起模型動(dòng)物體內(nèi)ET-1濃度升高，刺激內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶的活化，造成超氧化物過(guò)量生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起肺動(dòng)脈平滑肌層增厚、非肌性小血管的肌化等肺動(dòng)脈高壓的表現(xiàn)。

繼發(fā)于左向右分流的肺動(dòng)脈高壓與慢性缺氧性肺動(dòng)脈高壓病因有所不同，那么NOX4是否也參與了分流性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生?Hwang等［9］進(jìn)行動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)異常的液體層流剪切力可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞NOX4 mRNA的表達(dá)，增加O2－等活性氧的產(chǎn)生，而穩(wěn)定的層流剪切力則出現(xiàn)相反的情況。此發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，作為左向右分流型肺動(dòng)脈高壓的明確病因，異常增強(qiáng)的血流剪切力也可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞NOX4表達(dá)增強(qiáng)，活性氧的產(chǎn)生增加。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，隨著分流時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠在出現(xiàn)肺動(dòng)脈平均壓升高、右室肥厚等肺動(dòng)脈高壓改變的同時(shí)，肺組織中NOX4的表達(dá)也在逐步升高，NOX4 mRNA的表達(dá)水平由分流4周組的 0.27±0.08上升到分流 11周組的0.62±0.07，分流11周組的NOX4 mRNA水平與其他各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)合已有的研究結(jié)論，可以推測(cè)，左向右大量分流產(chǎn)生的異常血流剪切力作為始動(dòng)因素，造成肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞NOX4表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而大量產(chǎn)生活性氧，通過(guò)活性氧的第二信使作用，引發(fā)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，造成肺血管重構(gòu)及肺動(dòng)脈高壓。

本研究結(jié)果說(shuō)明，NOX4同樣參與了高肺血流性肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程，但分流型肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能還涉及到其他相關(guān)的信號(hào)途徑，本文僅是從NOX4的角度進(jìn)行了初步探討，其具體的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制需要進(jìn)一步研究闡明。

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