不同采收期刺槐花中刺槐苷和鼠李糖刺槐苷的測(cè)定

鄭永芹， 初正云， 王添敏， 翟延君

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連116600)

刺槐花為豆科植物刺槐屬刺槐Robinia pseudoacacia L.的干燥花，又名洋槐、江南槐、胡藤，原產(chǎn)于美國(guó)東部的阿柏拉契亞山脈和奧薩克山脈一帶，我國(guó)引種栽培的有刺槐和毛刺槐兩種［1-2］。因具有生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、耐鹽堿等優(yōu)點(diǎn)，目前得到大面積的種植［3］，覆蓋28個(gè)省 (市、自治區(qū))，黃河和淮河流域?yàn)榇袒痹耘嘀行膮^(qū)域［4］。刺槐花具有較高的藥用價(jià)值，具有消癰化瘀，清熱解毒，療咽治痔，健胃通腸等功效［5］。美國(guó)當(dāng)?shù)鼐用駥⒋袒弊鳛榇咄聞€有報(bào)道稱它可以使人和動(dòng)物興奮［6］，國(guó)內(nèi)民間多用來(lái)止血、殺菌消炎等。本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定刺槐花中的刺槐苷和鼠李糖刺槐苷的方法，并且對(duì)不同產(chǎn)地的花蕾、初開花及開放花中兩種成分進(jìn)行定量考察，期望為刺槐花采收期的確立和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100型高效液相色譜儀，配置四元泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、柱溫箱、ChemStaion化學(xué)工作站;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)，CP225D型十萬(wàn)分之一電子天平 (德國(guó)sartorius公司)

1.2 試藥 12個(gè)不同產(chǎn)地刺槐花的花蕾、初開花及開放花，均采自于遼寧大連市的不同地區(qū)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)初正云教授鑒定為豆科植物刺槐Robinia pseudoacacia L.的干燥花，并將12個(gè)不同產(chǎn)地的刺槐花依次編號(hào)為 S1、S2、S3…S12。刺槐苷和鼠李糖刺槐苷對(duì)照品均由本實(shí)驗(yàn)室分離得到，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)純度均大于98%。甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均是分析純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Agilent TC-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇 (A)-0.3%磷酸溶液 (B)梯度洗脫，0～5 min(20% ～32%A)，5～25 min(32% ～45%A)，25～30 min(45% ～68%A)，30～40 min(68% ～80%A)。體積流量為1 mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為349 nm，進(jìn)樣量20 μL，以峰面積為定量依據(jù)。在此色譜條件下，分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣，計(jì)算理論板數(shù)，以鼠李糖刺槐苷色譜峰計(jì)算不低于2500，分離度大于1.5，對(duì)照品和供試品色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)與供試品(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取刺槐苷12.84 mg，鼠李糖刺槐苷0.6 mg，精密稱定，分別置50 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液 (刺槐苷的質(zhì)量濃度為0.2568 mg/mL，鼠李糖刺槐苷的質(zhì)量濃度為0.012 mg/mL)。

2.3 供試品溶液的制備 取刺槐花粉末約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加50 mL石油醚，超聲10 min脫脂，濾去石油醚，揮干粉末，加70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，放冷至室溫，用70%的甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液，再微孔濾膜濾過，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取刺槐苷和鼠李糖刺槐苷對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6、7 mL，定容至10 mL，搖勻。吸取以上溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)定。以峰面積 (mAU)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果刺槐苷回歸方程為Y=1410.1X－37.457，r=0.9994，表明刺槐苷在質(zhì)量濃度為0.02568～0.17976 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;鼠李糖刺槐苷回歸方程為 Y =2795.4X－18.843，r=0.9999，表明鼠李糖刺槐苷在質(zhì)量濃度為0.0012～0.0084 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定刺槐苷和鼠李糖刺槐苷的峰面積，結(jié)果RSD分別為1.15%、1.04%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一樣品5份，按2.3項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液，進(jìn)樣分析，測(cè)定刺槐苷和鼠李糖刺槐苷的峰面積，計(jì)算，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.253% 、0.08937%，RSD分別為1.29%、1.32%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h測(cè)定刺槐苷和鼠李糖刺槐苷的峰面積，結(jié)果RSD分別為0.64%、1.16%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取0.25 g已測(cè)含有量的樣品9份，每3份分別加入刺槐苷對(duì)照品3、3.7、4.5 mg和鼠李糖刺槐苷對(duì)照品 0.6、0.8、1.0 mg，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別吸取供試品溶液20 μL進(jìn)樣，測(cè)定。計(jì)算得刺槐苷的平均回收率為98.21%，RSD為0，972%;鼠李糖刺槐苷的平均回收率為97.84%，RSD為1.17%。

2.9 樣品測(cè)定 分別精密稱取10個(gè)產(chǎn)地的刺槐花的花蕾、初開花及12個(gè)產(chǎn)地的開放花粉末，按2.3項(xiàng)下方法，制成供試品溶液，測(cè)定刺槐苷和鼠李糖刺槐苷，結(jié)果見表1。

2.10 兩種成分的含有量比較 采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用多重比較，對(duì)刺槐苷和鼠李糖刺槐苷進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 刺槐屬植物中的黃酮苷類化合物具有光譜活性和低毒性，如山柰酚、山柰酚-7-鼠李糖苷、刺槐苷、山柰酚-3，7-二鼠李糖苷、刺槐素都具有明顯的抗炎作用，后三者的活性均超過蘆?。?］。朝鮮也曾經(jīng)有報(bào)道用刺槐花中的鼠李糖刺槐苷制成了注射液，治療急、慢性腎炎、腎毒癥、尿毒癥、腎性高壓、膀胱炎和泌尿系統(tǒng)疾?。?］。本課題組采用經(jīng)典的MTT法實(shí)驗(yàn)，初步結(jié)果表明，刺槐苷和鼠李糖刺槐苷也有一定的抗癌活性。因此，本研究將刺槐花中的刺槐苷和鼠李糖刺槐苷，作為確定刺槐花采收期的指標(biāo)性成分。

表1 刺槐苷和鼠李糖刺槐苷的測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination of robinin and rhamnoroininin samples

表2 刺槐苷和鼠李糖苷含有量比較 (±s)Tab.2 Comparison of robinin and rhamnorobinin in samples(±s)

表2 刺槐苷和鼠李糖苷含有量比較 (±s)Tab.2 Comparison of robinin and rhamnorobinin in samples(±s)

注:與花蕾比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.001;與初開花比較，##P ＜0.001。

不同采收期的刺槐花 刺槐苷/% 鼠李糖刺槐苷/%0.09378±0.025202.298±0.3164 0.0675±0.03142初開花 (n=10) 1.924±0.3734* 0.08051±0.04108開放花 (n=12) 1.259 ±0.3213＊＊##花 蕾(n=10)

3.2 本研究采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示不同采收期對(duì)刺槐苷的含有量有顯著影響，花蕾與初開花相比較，花蕾顯著高于初開花 (P＜0.05);花蕾與開放花相比較，花蕾顯著高于開放花 (P＜0.001);初開花與開放花相比較，初開花顯著高于開放花 (P＜0.001)。結(jié)果還顯示鼠李糖刺槐苷的P值均大于0.05，故采收期對(duì)鼠李糖刺槐苷的影響很小，故可以忽略期對(duì)其的影響。綜上所述，刺槐花的采收期宜在花蕾和初開時(shí)期。

3.3 刺槐花氣味芳香、口感甜，此外刺槐花中還含有極為豐富的三大營(yíng)養(yǎng)素、多種維生素、礦物質(zhì)，并含有一些高效生物活性物質(zhì)［9］。人們經(jīng)常食用刺槐花，民間流傳著一些食療方，如刺槐花芝麻餅、籠蒸刺槐花、槐花酥蝦、油煎刺槐花、刺槐花雞蛋湯等。此外，還有報(bào)道將刺槐花制成刺槐花飲料［10］、多維低糖槐花果醬［11］、脫水速溶花菜湯、花保健蜜酒、刺槐花營(yíng)養(yǎng)粥等［12］。本研究的結(jié)果可以使人們更好地利用刺槐花的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，從而達(dá)到中醫(yī)所提倡的“食療法”。

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