射干麻黃配伍對射干異黃酮類成分在大鼠體內藥代動力學的影響

楊萬軍， 張偉東， 王 瑩， 王 青， 顧 宜， 王 榮， 王曉娟

(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院藥劑科，陜西西安710032)

中藥射干為鳶尾科射干屬植物射干Belamcanda chinensis(L.)D C.的干燥根莖。射干的藥理作用明顯，具有清熱解毒、利咽消痰、散瘀消腫的功效［1］，主要用于治療流感及上呼吸道感染［2］。臨床上常與其他藥物配伍使用，如與麻黃配伍治療支氣管哮喘，其療效已為大量臨床應用所證實［3-5］。射干中含有豐富的異黃酮類成分，實驗研究證實其具有顯著的抗炎、祛痰平喘、抗病毒、抑菌作用［6-9］，本課題在藥效試驗 (文章另發(fā))基礎上，通過比較射干提取物與麻黃提取物配伍前后大鼠體內射干異黃酮類成分射干苷元、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素 (結構見圖1)的藥代動力學，揭示麻黃與射干配伍后射干異黃酮類成分在大鼠體內的變化規(guī)律，為射干、麻黃配伍提供現(xiàn)代科學依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 藥品與試劑 射干苷元 (Tectorigenin)、野鳶尾黃素 (Irigenin)、次野鳶尾黃素 (Irisforentin)分別由本實驗室分離獲得，純度＞98.0%;山柰酚(Kaempferol，批號1124S，購自北京恒元啟天化工院);甲醇、乙腈 (色譜純，德國Merck公司);甲酸 (色譜純，美國Agilent);Mili-Q超純水。β-葡萄糖醛酸酶 (規(guī)格1240000U/G，批號 G0251，美國SIGMA公司)。

1.2 儀器 6460型三重四極桿串聯(lián)質譜儀 (美國Agilent technology公司)，配有電噴霧離子源(ESI)及 MassHunter VersionB.04.10工作軟件;Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜系統(tǒng)，含G4220A二元泵、G1314E VWD檢測器、G1316C柱溫箱及G4226A自動進樣器。

圖1 3個黃酮類成分及內標山柰酚的化學結構Fig.1 Chemical structures of three isoflavonids and IS(kaempferol)

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18柱 (2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，Agilent在線過濾器;以乙腈(ACN)-水 (含0.1%甲酸FA)為流動相梯度洗脫 (洗脫梯度見表1)，柱溫30℃，進樣量5 μL。

表1 流動相洗脫梯度Tab.1 Mobile phase gradients

2.2 質譜條件 采用電噴霧電離源 (ESI);掃描方式為多反應監(jiān)測模式 (MRM);噴霧氣壓為310.275 kPa，霧化器溫度為350℃;毛細管電壓為正離子4 kV，負離子3.5 kV;氣流速度10 L/min。掃描時間為13 min。用于定量分析的離子反應及質譜參數(shù)見表2。

表2 定量離子及質譜參數(shù)Tab.2 Isoflavonids MRM transitions

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱取鳶尾苷元41.08 mg、野鳶尾黃素44.64 mg、次野鳶尾黃素44.64 mg，用甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，配成質量濃度分別為4.108、4.464、4.464 mg/mL的混合對照品溶液，4℃保存。

2.3.2 實驗藥品的配制 準確稱取射干浸膏1 g 2份，其中一份加入1 g麻黃浸膏，分別用0.1%CMC-Na溶液20 mL溶解混勻，配成50 mg/mL的射干浸膏溶液和藥對溶液。

2.3.3 β-葡萄糖醛酸酶的配制 稱取28.39 mg β-葡萄糖醛酸酶，乙酸銨溶液 (pH4.7)溶解定容至100 mL量瓶中 (合3520 U/mL)，保存于－20℃冰箱中。整個操作須于冰面上進行。

2.4 給藥方案與樣品采集 雄性Sprague-Dawley大鼠12只，體質量 (200±15)g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(軍2009027)，給藥前禁食12 h，隨機分為兩組:射干組灌胃給予射干浸膏溶液2.5 mL/只，藥對組給予藥對溶液2.5 mL/只 (經(jīng)測定，合給藥劑量射干苷元31.6 mg/kg，野鳶尾黃素8.5 mg/kg，次野鳶尾黃素14.6 mg/kg)。給藥后0、5、10、15、30 min和1、2、3、5、8、12、24 h自眼底靜脈取血0.3 mL置肝素化的EP管中，室溫靜置約30 min后3000 r/min離心5 min，轉移上層血漿貯存于－20℃。

2.5 樣品處理 50 μL血漿中加入50 μL β-葡萄糖醛酸酶渦旋混勻，37.5℃水浴搖床孵育5 h，加1 μL山柰酚內標溶液 (10 ng/mL)渦旋1 min，2 mL乙酸乙酯萃取兩次，12000 r/min離心10 min，上清液45℃氮氣吹干，100 μL甲醇復溶，過0.22 μm濾膜進樣測定。

2.6 數(shù)據(jù)處理 應用DAS 2.0藥代動力學軟件求出藥代動力學參數(shù)，采用SPSS 13.0軟件中Wilcoxon秩和檢驗和t檢驗對各組的藥代動力學參數(shù)進行分析。

2.7 測定方法的建立

2.7.1 方法的專屬性 空白血漿、空白血漿加分析物標準品及給藥后的血漿樣品色譜圖見圖2。結果顯示，空白血漿在與對照品對應的保留時間處沒有色譜峰，3個成分及內標均達到基線分離，說明血漿內源性物質、代謝產物及其他成分均不干擾3個目標成分的檢出。

圖2 空白血漿 (A)、加有對照品和內標物的血漿 (B)和大鼠灌胃給藥后的血漿(C)色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of blank plasma(A)，spiked plasma with targets and the IS(B)，and the plasma from rats after administration(C)

2.7.2 標準曲線及檢測靈敏度 取混合對照品用甲醇按1∶10逐級倍量稀釋得不同質量濃度的系列對照品，分別取100 μL空白血漿和100 μL山柰酚內標液對應稀釋，按樣品處理項下的方法進行處理，得終質量濃度分別為射干苷元2.054～410.8 ng/mL，野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素2.232～446.4 ng/mL的標曲樣品，進樣測定后以目標物和內標物的峰面積比Y對目標物質量濃度C作圖。結果見表3。3個成分的定量下限 (LLOQ)分別為2.054、2.232、2.232 ng/mL。

表3 標準曲線及線性范圍Tab.3 Calibration curves and dynamic range

2.7.3 準確度與精密度 用空白血漿配制高、中、低3個質量濃度的質控樣品各5份，測得峰面積后帶入隨行標準曲線計算相應的藥物質量濃度，與理論值相比，計算方法的準確度;同一質量濃度每隔2 h測定1次，測定3次，計算日內精密度;每隔1 d測定1次，測定3次，測定日間精密度。結果見表4。日內和日間精密度RSD值均小于9%，準確度在93.4%～98.1%之間。

2.7.4 提取回收率 用空白血漿配制高、中、低3個濃度的質控樣品各5份，按樣品處理項下的方法進行處理。測得峰面積后與同濃度對照品溶液直接進樣所得峰面積進行比較，計算提取回收率。結果見表5。結果顯示高中低質控樣品有著一致的回收率。

表4 準確度與精密度實驗結果(n=5)Tab.4 Results of accuracy and precision(n=5)

表5 回收率實驗結果 (n=5)Tab.5 Results of recoveries(n=5)

2.7.5 樣品穩(wěn)定性實驗 配制低、中、高3個質量濃度的空白血漿樣品各5份，貯存于－20℃冰箱中，反復凍融3次，每次間隔24 h，按樣品處理項下的方法進行處理后進樣測定，測得實際值均在理論值的92.3% ～98.3%范圍波動，RSD＜8.7%。表明樣品可以耐受3次凍融。低、中、高質量濃度空白血漿樣品室溫放置24 h，在－20℃冰箱中放置15日，或經(jīng)處理后在自動進樣器中放置24 h后測定均未見明顯下降，表明該3種成分在血漿樣品中穩(wěn)定性良好。

2.7.6 基質效應 用流動相分別配制含山柰酚內標液 (均為10 ng/mL)和射干苷元、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素的高 (328.64、357.12、357.12 ng/mL)、中 (41.08、44.64、44.64 ng/mL)、低(4.108、4.464、4.464 ng/mL)質量濃度混合標準品溶液;另取6份不同來源的大鼠空白血漿樣品，按樣品處理項下的方法提取，制得與上述標準品相同系列濃度的待測組分和內標物溶液，分別測得血漿基質樣品和相應濃度混合標準品溶液中待測組分及內標物的峰面積，并計算其峰面積比，結果其比值均在86.23%～92.71%之間，表明大鼠血漿生物基質不影響樣品測定。

2.8 大鼠給藥后的藥代動力學 應用建立的LC/MS方法，測定大鼠血漿藥物質量濃度，各時間點平均藥－時曲線見圖3。各組藥代動力學參數(shù)見表6。與射干單獨組相比，配伍后射干苷元的t1/2顯著延長，表明配伍使得射干苷元的消除變慢;3個成分的AUC(0→t)均顯著增加，提示配伍后促進了目標成分吸收進入體循環(huán);野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素的Cmax顯著增加;射干苷元及次野鳶尾黃素CLz/F明顯降低，體內清除過程變緩;次野鳶尾黃素Vz/F顯著降低;其余參數(shù)未見統(tǒng)計學差異。

圖3 兩組大鼠灌胃給藥后的平均藥時曲線(n=5)Fig.3 Plasma concentration-time profiles of isoflavonids in rat plasma(n=5)

表6 大鼠灌胃給予50 mg/kg射干浸膏及藥對浸膏后的藥動學參數(shù)(n=6)Tab.6 Mean pharmacokinetics parameters of the three isoflavonids after oral administration of extracts(n=6)

3 討論

葡萄糖醛酸化是單羥基或多羥基黃酮的主要代謝通路，口服給藥后，黃酮苷類在腸道菌群的作用下水解為苷元，進入體循環(huán)，又在UDPG-葡糖醛酸轉移酶的作用下轉化為葡萄糖醛酸結合物或苷的形式排出體外［10-12］。因此本實驗加入了葡萄糖醛酸酶對樣品進行水解，所得到的結果為總苷元。結果顯示，3個檢測成分在5 min時即可檢測到且達峰時間均在0～0.5 h內，提示這3種成分在胃部被很快吸收入血;藥時曲線呈現(xiàn)雙峰，提示這3種成分在吸收過程中可能存在腸-肝循環(huán)、腸-腸循環(huán)或胃-腸循環(huán)。配伍后射干3種異黃酮苷元成分的t1/2、AUC(0－t)等藥代動力學參數(shù)發(fā)生顯著了變化，提示麻黃與射干配伍后在大鼠體內產生了藥代動力學的相互影響，其發(fā)生作用的環(huán)節(jié)是否影響藥物代謝酶、腸道菌群或者是產生了相互的物理化學作用，尚需進一步深入研究。配伍使得射干異黃酮成分的作用更為持久，一定程度上驗證了射干-麻黃這一經(jīng)典藥對配伍的科學性。

前期本課題組考察了射干單用與射干麻黃藥對配伍使用治療小鼠支氣管哮喘的藥效學差異 (實驗結果另行發(fā)表)，結果配伍優(yōu)于射干單獨使用。配伍導致的藥代動力學差異可能是其產生藥效學差異的原因之一。

本實驗建立了快速靈敏的檢測3種射干異黃酮成分的UHPLC-MS/MS方法，可為進一步研究有關射干的藥代動力學或定量檢測提供參考。

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