腎炎康復片對實驗性糖尿病腎病大鼠藥效作用研究

王 蕾， 苗淑杰， 李 旭， 種影影， 王 佳， 陳衛(wèi)平

(1.天津市醫(yī)藥科學研究所，天津300020;2.天津同仁堂股份有限公司，天津300381)

腎炎康復片是天津同仁堂股份有限公司研制的國家級新藥，主治慢性腎小球腎炎屬于氣陰兩虛、脾腎不足、毒熱未消證者，表現(xiàn)為神疲乏力，腰腿酸軟，面浮腳腫，頭暈耳鳴，蛋白尿，血尿等。有臨床報道，腎炎康復片對糖尿病腎病 (DN)亦有明顯治療作用，可有效控制血糖［1］，減少尿蛋白排泄量，減輕水腫癥狀［2］。本實驗旨在運用藥理學實驗方法，觀察腎炎康復片對實驗性糖尿病腎病大鼠的治療作用，并揭示其對糖尿病腎病病變靶器官腎臟功能改善作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及飼料 Wistar大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。許可證編號:SCXK(京)2007-0001。

普通全價顆粒飼料Ⅱ號，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產，京動許字 (2000)第015號。動物飲用純凈水。

1.2 實驗藥物 腎炎康復片 (由天津同仁堂股份有限公司提供，批號:B81003)，每克藥粉含2.5 g生藥。將腎炎康復片藥粉用純凈水配制成0.6、0.3、0.15 g生藥/mL的腎炎康復片藥粉混懸液待用;鹽酸吡格列酮片 (北京太洋藥業(yè)有限公司，批號:070201);鏈脲佐菌素 (STZ)(北京市博愛科貿有限責任公司分裝Sigma-S0130)。

1.3 實驗設備 全自動生化儀 (SaBa18);紫外分光光度計 (島津UV-260);離心機 (80-1，上海手術器械廠);恒溫水浴箱 (S648，上海醫(yī)療器械廠);大鼠代謝籠。

1.4 實驗用試劑盒 糖化血紅蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20070713);尿蛋白定量試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號:20070714);肌酐試劑盒測定法 (中生北控生物科技有限公司，批號:070821);葡萄糖液體試劑盒 (中生北控生物科技有限公司，批號:070861)。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型的建立［3-5］大鼠經背部切口行右腎切除術，假手術對照組僅對皮膚和肌肉進行切開、縫合操作，不切除腎臟。2周后，經尾靜脈注射 STZ 1次 (35 mg/kg，溶于 pH 4.5、0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液中)誘導糖尿病腎病模型，假手術對照組僅注射等體積的枸櫞酸緩沖液。72 h后，空腹眼眶內眥采血測血糖，將血糖≥11.1 mmol/L為模型入選標準，然后按照血糖值將大鼠隨機分成模型對照組、鹽酸吡格列酮10 mg/kg對照藥組、腎炎康復片6、3、1.5 g生藥/kg三個劑量組，相當于臨床人用劑量的30、15、7.5倍。

2.2 實驗方法 各組大鼠每日灌胃相應藥物1次/d，給藥體積10 mL/kg，假手術與模型對照組分別灌胃等體積純凈水，共11周。實驗結束前，代謝籠收集24 h尿液，量取尿量后，2000 r/min離心10 min，去沉淀，－20℃保存待測尿肌酐、尿蛋白水平。用戊巴比妥鈉 (45 mg/kg)腹腔麻醉，腹主動脈取血測定血糖、糖化血紅蛋白、血清肌酐、血清尿素氮。取左側腎臟，剝離被膜后，用17%的福爾馬林液固定，常規(guī)制片，光鏡檢查，測量腎小球直徑和面積。

2.3 統(tǒng)計方法 所得數(shù)據(jù)均經SPSS11.5統(tǒng)計軟件多組間方差分析，以均數(shù)±標準差 (±s)表示。

3 實驗結果

3.1 腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠血糖、糖化血紅蛋白的影響 糖尿病腎病模型對照組Glu和HbA1c與假手術對照組比較明顯升高 (P＜0.001，P＜0.001);腎炎康復片6 g生藥/kg組大鼠Glu和HbA1c比模型對照組明顯降低 (P＜0.01，P＜0.05)。數(shù)據(jù)見表1。

表1 腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠血糖、糖化血紅蛋白的影響(±s)Tab.1 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on Glu，HbA1c in rats(±s)

表1 腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠血糖、糖化血紅蛋白的影響(±s)Tab.1 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on Glu，HbA1c in rats(±s)

注:模型對照組與假手術對照組t檢驗，△△△P＜0.001;各給藥組與模型對照組方差分析，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 動物數(shù)/只(mmol·L )(HbA1c)/(g·mL )10 8.60± 2.20 28.24±3.0810 28.18±10.93△△△ 37.73±2.58△△△10 24.21± 9.72 33.82±2.70★10 12.42± 8.05★★ 33.90±2.87★10 22.71±12.82 35.26±3.6010 18.09± 9.35 34.90±2.90血糖(Glu)/－1糖化血紅蛋白－1假手術對照組腎炎康復片6 g生藥/kg組模型對照組鹽酸吡格列酮10 mg/kg組腎炎康復片1.5 g生藥/kg組腎炎康復片3 g生藥/kg組

3.2 腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠腎功能的影響糖尿病腎病模型對照組血清BUN、Scr水平明顯升高 (P＜0.001，P＜0.01)，表明腎功能受到嚴重損害;腎炎康復片6 g、1.5 g生藥/kg組Scr較模型對照組明顯降低 (P＜0.05，P＜0.05)，各劑量組血清BUN均有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。數(shù)據(jù)見表2。

表2 對大鼠血清尿素氮、血清肌酐的影響(±s)Tab.2 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on BUN，Scr in rats(±s)

表2 對大鼠血清尿素氮、血清肌酐的影響(±s)Tab.2 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on BUN，Scr in rats(±s)

注:模型對照組與假手術對照組t檢驗，△△P＜0.01，△△△P＜0.001;各給藥組與模型對照組方差分析，★P＜0.05。

組 別 動物數(shù)/只血清尿素氮(BUN)/(mmol·L －1)血清肌酐(Scr)/(mmol·L －1)假手術對照組10 21.40± 8.66 98.20±10.04腎炎康復片6 g生藥/kg組10 5.70± 1.44 90.20± 6.66模型對照組 10 25.62± 8.67△△△ 107.60±15.59△△鹽酸吡格列酮10 mg/kg組10 17.16±10.53 100.90±14.74腎炎康復片1.5 g生藥/kg組10 19.08± 9.71 92.80± 9.45★腎炎康復片3 g生藥/kg組10 17.33± 6.82 91.10± 6.35★

糖尿病腎病大鼠尿量明顯增加 (P＜0.01)、尿肌酐水平明顯降低 (P＜0.05)、尿蛋白水平明顯增加 (P＜0.01)，表明其腎功能損害，肌酐清除功能降低，腎小球濾過膜功能和腎小管重吸收功能障礙使蛋白分子隨尿液排出，形成蛋白尿。腎炎康復片各劑量組可使糖尿病腎病大鼠尿量減少、使尿肌酐水平有增加趨勢，但無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)，腎炎康復片6 g生藥/kg可使糖尿病腎病大鼠尿中蛋白水平明顯降低 (P＜0.05)。數(shù)據(jù)見表3。

3.3 腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠腎臟組織形態(tài)的影響 與假手術對照組比較，模型對照組腎臟病變顯著，多數(shù)腎小球直徑明顯增大，可見腎小球基底膜增厚，系膜細胞增生;多數(shù)大鼠腎小管上皮細胞腫脹，空泡變性明顯，尤以遠曲小管為著。與模型對照組比較，給藥組均有不同程度改善，腎病變顯著減輕;多數(shù)動物腎小球直徑增大不明顯，腎小管空泡變性范圍亦明顯縮小。腎炎康復片6 g生藥/kg組改善作用更為顯著。數(shù)據(jù)見表4。

表3 腎炎康復片對大鼠尿量、尿肌酐、尿蛋白的影響(±s)Tab.3 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on VOL，Cr，Pro in rats(±s)

表3 腎炎康復片對大鼠尿量、尿肌酐、尿蛋白的影響(±s)Tab.3 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on VOL，Cr，Pro in rats(±s)

注:模型對照組與假手術對照組t檢驗，△P＜0.05，△△P＜0.01;各給藥組與模型對照組方差分析，★P＜0.05。

組 別 動物數(shù)/只 尿量(VOL)/mL 尿肌酐(Cr)/(mol·L－1) 尿蛋白(Pro)/(ng·h－1·24－1)10 43.40±44.19 2558.60±1818.40 31.33±31.93模型對照組 10 115.30±62.10△△ 1019.40±295.46△ 102.33±52.33△△鹽酸吡格列酮10 mg/kg組 10 133.00±29.76 1010.60±328.58 93.84±24.12腎炎康復片6 g生藥/kg組 10 79.44±26.80 1605.90±1288.47 54.69±25.35★腎炎康復片3 g生藥/kg組 10 110.30±33.01 1129.20±215.07 78.21±29.07腎炎康復片1.5 g生藥/kg組假手術對照組10 98.10±32.29 1198.70±352.83 71.13±25.39

表4 腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠腎臟組織病理的影響Tab.4 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on kidney pathology in rats(±s)

表4 腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠腎臟組織病理的影響Tab.4 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on kidney pathology in rats(±s)

注:假手術對照組與模型對照組t檢驗，△P＜0.05;各給藥組與模型對照組方差分析，★P＜0.05，★★P＜0.01，★★★P＜0.001。

組 別 動物數(shù)/只指標腎小球直徑/μm腎小球面積/(×102×μm2)假手術對照組10 90.9 ±6.3 74.6 ±11.7模型對照組 10 119.3 ±11.2△ 115.9 ±23.8△鹽酸吡格列酮10 mg/kg組 10 100.0±10.6★★★ 88.0 ±15.1★★腎炎康復片6 g生藥/kg組 10 104.3±8.4★★ 99.6±13.2腎炎康復片3 g生藥/kg組 10 115.5±5.8 113.0±4.8腎炎康復片1.5 g生藥/kg組 10 108.8±7.0★106.0 ±13.1

4 討論

糖尿病腎病是臨床常見和多發(fā)的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，主要指糖尿病腎小球硬化癥，是以血管損害為主的腎小球病變。糖尿病早期腎體積增大，腎小球濾過率增加，呈高濾過狀態(tài)，以后逐漸出現(xiàn)間隙蛋白尿或微量白蛋白尿，隨著病程的延長出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫、高血壓、腎小球濾過率降低，進而可以發(fā)展為腎功能不全、尿毒癥。

實驗性糖尿病腎病可通過對大鼠體內注射鏈脲佐菌素 (STZ)進行復制，STZ的作用是破壞胰島β細胞，使其喪失分泌功能，隨著病程的進展形成糖尿病腎病。常用STZ腹腔注射劑量為60 mg/kg［6-9］，但造模周期較長，若合并一側腎臟全部或部分切除術，可縮短實驗周期，并減少STZ用量，使模型得以優(yōu)化［10-11］。本實驗采用右側腎臟全切術合并STZ 35 mg/kg靜脈注射的方法制備糖尿病腎病大鼠模型。糖尿病腎病大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、消瘦等典型糖尿病消耗體征，血糖值和糖化血紅蛋白明顯升高，且11周內保持穩(wěn)定，腎功能損傷明顯，血肌酐、尿素氮明顯升高，尿蛋白排泄量異常增高，尿肌酐明顯降低，光鏡下可見腎小球直徑明顯增大，基底膜增生增厚，腎小管上皮細胞腫脹。以上大鼠體征和數(shù)據(jù)表明，該方法制備的實驗性糖尿病腎病模型是成功的，其癥狀明顯，生化指標穩(wěn)定，組織病理改變與臨床糖尿病腎病病變機理模擬相似度較高，該方法可用于觀察藥物對糖尿病腎病的治療及作用機制研究。

本實驗數(shù)據(jù)表明，腎炎康復片對糖尿病腎病大鼠治療作用是肯定的，其作用特點可從以下幾方面分析:(1)降糖作用，有效控制血糖是防止和延緩糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素。高血糖可引起腎臟一系列病理生理改變，包括糖化產物增加，腎小球濾過率增高，氧化應激增強，蛋白激酶和轉化因子增強，這些都是導致腎小球損害的主要因素。除血糖指標之外，HbA1c亦是重要的糖尿病監(jiān)控指標。HbA1c是血液中紅細胞內的血紅蛋白與血糖結合的產物，該產物的結合是不可逆反應，并與血糖濃度成正比，且保持120 d左右，所以HbA1c最重要的意義在于，它可反映糖尿病患者近8～12周的血糖控制情況，不受偶爾一次血糖升高或降低的影響，現(xiàn)已作為國際公認的糖尿病監(jiān)控“金標準”。腎炎康復片可使糖尿病腎病大鼠Glu和HbA1c有效降低，針對高血糖癥這一最基本因素起到有效調控作用，是其延緩和治療腎臟并發(fā)癥的前提和先決條件。(2)改善腎功能，針對糖尿病并發(fā)的腎臟病變，腎炎康復片可直接作用于病變靶器官，通過干預治療后，糖尿病腎病大鼠多尿、蛋白尿的癥狀均得到改善。血清肌酐明顯低于模型對照組，尿肌酐的排泄功能亦有所改善，尿蛋白排泄量明顯減少，這些數(shù)據(jù)均表明腎炎康復片對腎小球和腎小管的功能起到修復和改善作用。(3)腎臟組織形態(tài)，腎炎康復片給藥組腎臟病變顯著減輕，減輕程度有明顯劑量—效應關系，6 g/kg組多數(shù)動物腎小球直徑增大不明顯，腎小球空泡變性范圍亦明顯縮小，改善效果最明顯，其他劑量組亦有不同程度的修復作用。

通過本次實驗表明，在實驗性糖尿病腎病的基礎上，可觀察出腎炎康復片對糖尿病合并腎損傷有明顯治療作用，在有效控制高血糖癥的同時，亦能延緩和改善糖尿病腎病的發(fā)展。

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