黃連解毒湯及其不同配伍組方成分溶出變化研究

劉冬敏， 劉樹(shù)民， 祖金祥， 盧 芳， 荊 雷， 何 薇， 黃志桓

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

黃連解毒湯是清熱解毒方中的經(jīng)典方劑，該方由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成。方中黃連和黃柏的主要有效成分為多種小檗堿型生物堿［1］，亦是本方的主要成分，文獻(xiàn)［2-4］表明二藥配伍可顯著增加生物堿的溶出。黃芩的主要成分為黃酮類［5-6］，梔子的主要成分為環(huán)烯醚萜類［7-8］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃連解毒湯及其可配伍組合的10個(gè)拆方的水煎劑及煎劑中的生物堿、黃酮類、環(huán)烯醚萜類進(jìn)行了溶出變化的測(cè)定分析，并與原藥材中的含有量進(jìn)行比較，研究了傳統(tǒng)水煎復(fù)方黃連解毒湯中有效成分生物堿、黃酮類、環(huán)烯醚萜類的溶出變化情況。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津);KQ-1007DB型數(shù)控超聲波清洗儀;上海良平儀器表有限公司-FA2004型電子天平(d:0.0001 g)。

1.2 試劑 乙腈 (色譜純，美國(guó)Fisher);甲醇(色譜純，美國(guó)DIKMA);娃哈哈純凈水(吉林市吉林經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)磐石工業(yè)園);其他試劑為分析純。

1.3 試藥 黃連產(chǎn)自四川，黃柏產(chǎn)自四川，黃芩產(chǎn)自黑龍江，梔子產(chǎn)自江西，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院王連芝副研究員分別鑒別為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch的干燥根莖，蕓香科植物黃皮樹(shù)Phellodendron amurense Rupr除去粗皮的干燥樹(shù)皮，唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)。黃連解毒湯樣品為將四味藥按配方比例［黃連-黃芩-黃柏-梔子(3∶2∶2∶3)］的自提水煎液干燥品，共7批。黃連解毒湯11個(gè)配伍組方樣品為按全方比例配伍自提水提物。

黃連堿對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為08109);梔子苷對(duì)照品(批號(hào)為110749-200613)，黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)為110715-200514)，漢黃芩素對(duì)照品(批號(hào)為111514-200403)，鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)為110713-200609)，鹽酸藥根堿對(duì)照品(批號(hào)為0733-200005)，鹽酸巴馬汀對(duì)照品(批號(hào)為110732-200506)，黃芩素對(duì)照品(批號(hào)為111588-200501)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;綠原酸對(duì)照品(SIGMA-ALORICH，批號(hào)為048KBB)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil(TM)-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm);流動(dòng)相為甲醇-水(含 0.1%醋酸)，梯度洗脫(洗脫條件見(jiàn)表1);柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;體積流量 1.0 mL/min;進(jìn)樣量 10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution method of mobile phase

2.2 樣品制備

2.2.1 供試品溶液的制備 1號(hào)煎劑(HLJD):600 g［黃連、黃芩、黃柏、梔子(3∶2∶2∶3)］浸泡2 h后，分別用8倍、6倍蒸餾水加熱回流1.5 h，四層紗布三層脫脂棉過(guò)濾，合并兩次濾液，60℃水浴揮干，電熱鼓風(fēng)干燥箱40℃烘干，過(guò)120目篩制成干細(xì)粉。2號(hào)(LQ):600 g［黃連、黃芩(3 ∶2)］、3號(hào)(LB):600 g［黃連、黃柏(3 ∶2)］、4號(hào)(LZ):600 g［黃連、梔子(3 ∶3)］、5 號(hào)(QB):600 g［黃芩、黃柏(2∶2)］、6 號(hào)(QZ):600 g［黃芩、梔子(2 ∶3)］、7號(hào)(BZ):600 g［黃柏、梔子(2 ∶3)］、8 號(hào)(LQB):600 g［黃連、黃芩、黃柏(3 ∶2 ∶2)］、9 號(hào)(LQZ):600 g［黃連、黃芩、梔子(3 ∶2 ∶3)］、10 號(hào)(LBZ):600 g［黃連、黃柏、梔子(3 ∶2 ∶3)］、11 號(hào)(QBZ):600 g［黃芩、黃柏、梔子(2 ∶2 ∶3)］、12 號(hào)(L):600 g黃連(600 g)、13號(hào)(Q):600 g黃芩(600 g)、14號(hào)(B):600 g黃柏(600 g)、15號(hào)(Z):600 g梔子(600 g)煎煮方法和干燥方法同1號(hào)煎劑。

精密稱定1號(hào)煎劑生藥250 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容至25 mL，超聲溶解30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的量配成10 mg/mL供試液，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾兩次，取續(xù)濾液，得1號(hào)供試液。2～15號(hào)煎劑生藥粉按比例同1號(hào)供試液分別配成 5、5、6、4、5、5、7、8、8、7、3、2、2、3 mg/mL 供試液體，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾2次，取續(xù)濾液，分別得到2號(hào)～15號(hào)供試液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃連堿對(duì)照品、梔子苷對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、漢黃芩素對(duì)照品、鹽酸小檗堿對(duì)照品、鹽酸藥根堿對(duì)照品、鹽酸巴馬汀對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品適量，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為 10 μg/mL的溶液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，得到9個(gè)對(duì)照品溶液，供分析用。

2.3 參照峰的選擇 將按照2.2項(xiàng)條件處理得到的供試品和9個(gè)對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)條件進(jìn)行色譜分析知，黃連解毒湯高效液相色譜圖譜中10、16、20、21、23、24、38、45、49 號(hào)峰的色譜峰依次為綠原酸、梔子苷、黃連堿、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素，因黃連為方中君藥，且色譜圖譜中以鹽酸小檗堿峰面積最大且出峰穩(wěn)定可靠，故選最強(qiáng)峰23號(hào)鹽酸小檗堿峰為參照峰。

2.4 共有峰的確定 通過(guò)7批固形物的指紋圖譜測(cè)定，比較其色譜圖，確定共有峰為50個(gè)(見(jiàn)圖1)。其中峰面積超過(guò)4%的色譜峰為16號(hào)，20號(hào)，23號(hào)，24號(hào)，38號(hào)，45號(hào)，49號(hào)峰。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取黃連解毒湯同一批次供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定高效液相圖譜，分別對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本沒(méi)有明顯變化(RSD＜3%)，符合指紋圖譜的要求。

圖1 黃連解毒湯高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of HLJD

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h 進(jìn)樣檢測(cè)，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，相對(duì)峰面積比值的RSD均小于3%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按前述方法制備供試品溶液5份，分別進(jìn)樣檢測(cè)，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，相對(duì)峰面積比值的RSD均小于3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.6 黃連解毒湯10個(gè)配伍組方以及四味單味藥高效液相圖譜的建立 按黃連解毒湯指紋圖譜梯度洗脫2.1項(xiàng)條件，將2.2.1項(xiàng)制備的2～15號(hào)煎劑供試液分別進(jìn)樣分析，得到10個(gè)配伍組方和4個(gè)單味藥高效液相圖譜(見(jiàn)圖2);并且對(duì)10個(gè)配伍組方和4個(gè)單味藥各峰的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

圖2 黃連解毒湯10個(gè)配伍組方和4個(gè)單味藥高效液相圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of ten combinations and four single herbs of HLJD

2.7 色譜峰歸屬 由復(fù)方、10個(gè)配伍組方結(jié)合4個(gè)單味藥高效液相譜圖分析結(jié)果知，黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、梔子苷、綠原酸、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素在15個(gè)組方中峰面積所占比例均超過(guò)4%，且黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀均屬于生物堿成分，可粗略代表方劑中總生物堿的量;梔子苷屬于環(huán)烯醚萜類成分，可粗略代表方劑中環(huán)烯醚萜的量;黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素均屬于黃酮類成分，可粗略代表方劑中總黃酮類成分量。從以上9個(gè)成分分別對(duì)黃連解毒湯和10個(gè)配伍組方的色譜峰進(jìn)行歸屬分析，結(jié)果見(jiàn)表2～4。由9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品分析四味單味藥成分，可得黃連色譜峰中14號(hào)峰(L14)為黃連堿，15號(hào)峰(L15)為藥根堿，17號(hào)峰(L17)為小檗堿，18號(hào)峰(L18)為巴馬汀;黃芩色譜峰中5號(hào)峰(Q5)為黃芩苷，11號(hào)峰(Q11)為黃芩素，15號(hào)峰(Q15)為漢黃芩素;黃柏色譜峰中14號(hào)峰(B14)為小檗堿，15號(hào)峰(B15)為巴馬汀;梔子色譜峰9號(hào)峰(Z9)為綠原酸，梔子色譜峰中12號(hào)峰(Z12)為梔子苷。

表2 黃連解毒湯及其配伍組方中生物堿類色譜峰歸屬Tab.2 Chromatographic peaks attribution of alkaloids in HLJD and its different combinations

3 討論

3.1 色譜條件的確定 通過(guò)對(duì)樣品在190～400 nm的三維色譜圖和各對(duì)照品最大吸收波長(zhǎng)的分析，選擇 4 個(gè)不同波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，分別是 240［9］，280［10］，340［11］和 254［12］nm，再對(duì) 4 個(gè)波長(zhǎng)下檢測(cè)的色譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)254 nm波長(zhǎng)檢測(cè)的色譜圖基線較平，且能最大程度地反映黃連解毒湯中所含的3類組分的化學(xué)信息，故最后選擇254 nm作為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

表3 黃連解毒湯及其配伍組方中黃酮類色譜峰歸屬Tab.3 Chromatographic peaks attribution of flavonoids in HLJD and its different combinations

表4 黃連解毒湯及其配伍組方中環(huán)烯醚萜類色譜峰歸屬Tab.4 Chromatographic peaks attribution of iridoids in HLJD and its different combinations

實(shí)驗(yàn)中首先考察了不同系統(tǒng)的流動(dòng)相，包括乙腈-水，乙腈-水(含 0.1% 磷酸)，乙腈-水(含 0.1%醋酸)，甲醇-水，甲醇-水(含 0.1% 醋酸)，結(jié)果表明以甲醇-水(含0.1%醋酸)效果最好，本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件能將各單味藥主要成分在170 min內(nèi)洗脫，且各類主要成分能得到良好的分離，從而保證最大限度體現(xiàn)四味藥的特征。

3.2 生藥水煎液中主要成分溶出變化分析 按2.2.1項(xiàng)方法煎煮得到的各配伍組方煎劑進(jìn)行HPLC檢測(cè)后，以單味黃連、黃芩、黃柏、梔子水煎液所得生物堿類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類的色譜峰面積作為基準(zhǔn)，分析黃連解毒湯和各拆方中上述三類物質(zhì)溶出變化情況。結(jié)果可見(jiàn)，生物堿的溶出量與單味生藥比較明顯下降，但黃酮類和環(huán)烯醚萜類成分溶出量明顯增加，且由于配伍的不同，煎液中各成分的相互影響不同，從而使單個(gè)化學(xué)成分和某類化學(xué)成分總量減少或增加也不盡相同。(1)生物堿類:LB配伍生物堿溶出增加為單味藥的101.0%，剩余配伍組合均減少;其中四味藥配伍損失最大為原來(lái)的43.3%;其次LQB配伍損失為原來(lái)的57%;LBZ配伍黃連堿、藥根堿、小檗堿均少量損失，巴馬汀少量增加，生物堿損失為原來(lái)的88.7%;LQZ配伍黃連堿、藥根堿、小檗堿均大量損失，巴馬汀少量增加;BZ小檗堿少量減少，巴馬汀少量增加，故推測(cè)黃芩與黃連、黃柏配伍產(chǎn)生沉淀使生物堿溶出降低。(2)環(huán)烯醚萜類:LZ、BZ、LBZ配伍綠原酸、梔子苷等環(huán)烯醚萜類分別增加為原來(lái)的111.5%、124.5%、137.2%;QZ、QBZ、LQZ 配伍分別降低為 77.3%、79.2%、99.4%;LZ配伍綠原酸少量減少，梔子苷明顯增加為原來(lái)的137.4%，故推測(cè)黃芩與梔子配伍使環(huán)烯醚萜類成分溶出降低，四藥配伍溶出增加為112.6%。(3)黃酮類:LQ、QB、QZ、LQB、LQZ 配伍使黃酮類溶出分別增加為原來(lái)的 127.9%、144.9%、139.6%、159.6%、136.1%;QBZ 配伍使黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類成分溶出明顯減低為原來(lái)的25.3%;但四藥配伍可以增加其的溶出為480.7%。

4 小結(jié)

目前對(duì)黃連解毒湯及其配伍拆方的成分研究國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均較多，但均較不全面，本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃連解毒湯可配伍組合的所有拆方進(jìn)行了研究，得出了較為全面的分析結(jié)果。從本研究可知，雖然復(fù)方中生物堿的量明顯少于單味生藥，但臨床上復(fù)方的療效明顯優(yōu)于單味生藥，說(shuō)明多個(gè)生物堿以合理的比例同時(shí)作用于機(jī)體時(shí)產(chǎn)生的藥效要優(yōu)于單個(gè)生物堿的作用;而且除了生物堿之外其它兩類主要成分溶出均有所增加，說(shuō)明經(jīng)過(guò)了幾百年乃至上千年實(shí)踐證明的傳統(tǒng)復(fù)方黃連解毒湯其四藥配伍在臨床上產(chǎn)生的藥效優(yōu)于單味藥及其它配伍組方的藥效。本實(shí)驗(yàn)不僅為黃連解毒湯成分分析研究提供依據(jù)，并且為黃連解毒湯體內(nèi)成分研究打下了良好的基礎(chǔ)。

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