甜菜抗草甘膦除草劑基因的克隆

魯振強(qiáng)，楊克科 ，馬龍彪，紀(jì) 巖，孟劍俠，劉麗萍，陳連江

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校生化與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080）

甜菜（Beta vulgaris）是我國(guó)的主要糖料作物。然而，在甜菜的生產(chǎn)中，對(duì)幾乎所有的除草劑表現(xiàn)為高度敏感，危害程度相當(dāng)嚴(yán)重；從播種、出苗到除草的幾個(gè)階段，生長(zhǎng)都會(huì)受到除草劑的致命影響。隨著除草劑的大量應(yīng)用，以及在土壤中的殘留，除草劑已成為甜菜生產(chǎn)的一大災(zāi)害[1]。從遺傳上分析，這是甜菜的先天缺陷，只有通過(guò)導(dǎo)入外源的抗性基因，才能使甜菜產(chǎn)生對(duì)除草劑的抗性。

草甘膦（glyphosate），商品名農(nóng)達(dá)（Roundup），化學(xué)名稱為 N-（膦酸甲基）苷氨酸（N-phosphonomethylglycine），因其廣譜、高效等諸多優(yōu)點(diǎn)，是目前世界上使用最廣泛的除草劑。5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPs，EC 2.5.1.19）在植物中廣泛存在，該酶是芳香族氨基酸生物合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在莽草酸途徑中催化磷酸烯醇式丙酮酸 （phosphoenolpyruvate；PEP）和3-磷酸莽草酸（shikimate-3-phosphate；S3P）合成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate；EPSP），草甘膦的除草機(jī)理就是抑制EPSPs，使芳香族氨基酸缺乏，對(duì)植物細(xì)胞分裂、葉綠素合成、蒸騰、呼吸以及蛋白質(zhì)等代謝過(guò)程產(chǎn)生影響，從而擾亂生物體的正常代謝使其死亡[2－3]。

基于此，本研究以提高甜菜對(duì)草甘膦除草劑的抗性為研究目標(biāo)，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)抗性基因EPSPs的功能域進(jìn)行了克隆，并且確認(rèn)獲得了目的基因。這為后期構(gòu)建超表達(dá)EPSPs植物表達(dá)載體，對(duì)甜菜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，最終獲得抗草甘膦的甜菜材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

選用Ecotype Colombia型Arabidopsis thaliana為靶基因克隆的植物材料。BIOZOL（BioFlux）、pMD18-T載體、膠回收試劑盒（TaKaRa）；大腸桿菌DH5α（本實(shí)驗(yàn)室）；RNA電泳所用試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2 總RNA的提取與檢測(cè)

稱取1g植物幼嫩葉片組織，加入5mL BIOZOL試劑中，室溫溫育15min；離心；將上層清液中加入1/5體積的氯仿，冰浴15 min；再次離心，將上層清液中加入等體積異丙醇，于-20℃放置30min；離心后，將沉淀于1mL 70%乙醇中洗滌兩次，晾干后，溶于DEPC水中，儲(chǔ)存于-70℃?zhèn)溆?。利用紫外分光光度?jì)，分別在OD260和OD280條件下測(cè)定RNA的含量和純度，并將樣品的濃度稀釋成1μg/μL備用。取2μg總RNA，加入15.8μL變性液，電泳緩沖液為1×MOPs，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)一步確定RNA質(zhì)量。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)AtEPSPs基因的序列（GenBank No.NM_202267.1）信息，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)上游引物（5'-3'）：CGGGA TCCCG ATGCT AAAT；下游引物（5'-3'）：CGAGC TCGTT AATGC TTTGT G，擴(kuò)增 AtEPSPs 基因的CDS功能域長(zhǎng)度為1470 bp。擴(kuò)增引物由上海生工合成。

1.4 RT-PCR

在12μL的反應(yīng)體系中加入3μg RNA、10μM Oligo dT以及RNase free H2O于65℃反應(yīng)5min，并立即置于冰上；向第一步變性反應(yīng)液中加入5×RT Buffer，20mM dNTPs，10U RNase Inhibiter以及20U的Rever Tra Ace（ToYoBo），總體積為 20μL。 反應(yīng)條件為 42℃ 60min；99℃ 5min；4℃ 5min。 將產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴(kuò)增：50μL 的反應(yīng)體系中， 分別加入 2μL cDNA 模板，5μL 10×Taq Buffer、4μL 10mM dNTPs、1μL 20μM 上游引物和下游引物，0.5μL rTaq （TaKaRa）。 PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性 5min；94℃（30s），52℃（45s），72℃（3min），30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并利用GeneSnap 6.08（f）進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 酶切驗(yàn)證及序列測(cè)定

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，回收；將pMD18-T載體和AtEPSPs回收片段按照摩爾比1∶5進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)Amp抗性及藍(lán)白斑篩選出待測(cè)陽(yáng)性克隆。待測(cè)陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)提質(zhì)粒，酶切鑒定，最終進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 AtEPSPs基因CDS功能域的RT-PCR擴(kuò)增

2 結(jié)果與分析

2.1 抗草甘膦AtEPSPs基因的克隆

實(shí)驗(yàn)以Ecotype Colombia型Arabidopsis thaliana為靶基因克隆的植物材料，利用BIOZOL試劑提取了總RNA（圖1A）。電泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外燈下清晰可見(jiàn)，并且，28S rRNA的亮度是18S rRNA的2倍左右，這說(shuō)明RNA基本上沒(méi)有被降解，且無(wú)彌散。同時(shí)，加樣孔附近沒(méi)有雜帶，說(shuō)明產(chǎn)物中沒(méi)有DNA存在；在18S rRNA下方存在一些較為模糊的條帶，這可能是由tRNA，5.8S RNA和5S rRNA組成的遷移較快的條帶。這些結(jié)果都說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)獲得了較高純度和得率的總RNA。

以總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶成功獲得了cDNAs。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)在1.47kb的位置獲得了目的片斷（圖1B）。這與AtEPSPs基因的序列（GenBank No.NM_202267.1）的功能域的大小1.47 kb相一致。

圖2 pMD 18-T-AtEPSPs載體的構(gòu)建

2.2 測(cè)序載體pMD 18-T-AtEPSPs質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR獲得的AtEPSPs基因片段進(jìn)行回收，與pMD 18-T連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有 Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上。挑取白斑陽(yáng)性克隆，并對(duì)應(yīng)提取質(zhì)粒DNA。首先通過(guò)對(duì)AtEPSPs基因序列的限制性內(nèi)切酶分析，選取在AtEPSPs基因的EcoRI酶切位點(diǎn)處來(lái)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定；該限制性內(nèi)切酶在T載體上也有一個(gè)酶切位點(diǎn)。

如圖2A所示，經(jīng)過(guò)EcoRI酶切重組質(zhì)粒，獲得了兩條位于4.044kb和0.144kb左右位置的條帶，以及獲得了兩條位于2.838kb和1.35kb左右位置的條帶，分別與預(yù)計(jì)相符。片段的總長(zhǎng)為4.19kb左右，這與T載體（2.69kb）和AtEPSPs全長(zhǎng)（1.47kb）加起來(lái)的總長(zhǎng)基本一致；在確認(rèn)靶基因的正確性下，也進(jìn)一步明確了目的基因在T載體上的插入方向，根據(jù)EcoRI在AtEPSPs基因內(nèi)部以及T載體上的位置，可以確定AtEPSPs基因分別是正向（圖2A中的泳道1）、逆向（圖2A中的泳道2）插入到T載體上的。另外，采用PCR擴(kuò)增對(duì)這兩類陽(yáng)性質(zhì)粒載體進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如圖2B所示，與預(yù)期結(jié)果相符。并進(jìn)行了測(cè)序鑒定。

3 討論

本研究采用RT-PCR技術(shù)獲得了草甘膦除草劑抗性基因EPSPs的功能域序列，經(jīng)過(guò)分子鑒定獲得了確認(rèn)。這為后續(xù)進(jìn)行甜菜轉(zhuǎn)基因研究、獲得甜菜抗除草劑轉(zhuǎn)基因材料奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。迄今為止，雖然美國(guó)等抗除草劑甜菜品種已研制成功，但其申請(qǐng)專利保護(hù)，輸入并控制了包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家甜菜抗除草劑商用品種的價(jià)格，已形成了壟斷[4]。所以，本研究對(duì)抗草甘膦除草劑基因的克隆，不僅可以打破國(guó)外的壟斷，開發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗除草劑甜菜品種，實(shí)現(xiàn)我國(guó)甜菜生產(chǎn)對(duì)品種的自主性，具有重大理論價(jià)值。而且，更為重要的是對(duì)推動(dòng)甜菜生產(chǎn)，提高甜菜產(chǎn)量，增加農(nóng)民收入，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的科學(xué)意義。

[1]李玉萍.基因工程在甜菜育種中的研究現(xiàn)狀[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（2）：55-57.

[2]Cerdeira A L，Duke S O.The current status and environmental impacts of glyphosate-resistant crops：a review[J].J Environ Qual，2006，35：1633-1658.

[3]Gerald M D.Glyphosate-resistant crops：history，status and future[J].Pest Manag Sci.，2005，61：219-244.

[4]James C.Global status of commercialized biotech/GM Crops[M]：2008.NY：ISAAA，2009.