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    廣西甘蔗花葉病SCMV調(diào)查初報(bào)

    2012-09-10 10:42:16顏梅新黃偉華鄧展云黃誠(chéng)華韋金菊
    中國(guó)糖料 2012年1期
    關(guān)鍵詞:臺(tái)糖柳城花葉病

    顏梅新,黃偉華,鄧展云,黃誠(chéng)華,韋金菊

    (廣西壯族自治區(qū)甘蔗研究所/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530007)

    甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)引起的甘蔗花葉病是重要的甘蔗病害之一,在我國(guó)浙江[1]、福建[2]、廣東[3]、廣西[4]、云南[5]等地甘蔗產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,為害嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)外對(duì)SCMV特性、分類(lèi)地位、多樣性等方面進(jìn)行了研究,迄今,報(bào)道了200多個(gè)SCMV分離物CP基因序列,有的還進(jìn)行全基因組序列測(cè)定[6-8],許東林等2005年對(duì)華南地區(qū)引種基地侵染甘蔗的SCMV遺傳多樣性進(jìn)行報(bào)道[3]。廣西是SCMV的主要發(fā)生地區(qū)之一,但至今尚未對(duì)全區(qū)甘蔗品種品系間感SCMV進(jìn)行調(diào)查,為此我們進(jìn)行了相關(guān)研究。本文簡(jiǎn)要報(bào)道廣西蔗區(qū)侵染甘蔗SCMV的初步調(diào)查結(jié)果。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集與總RNA提取

    從廣西各主要蔗區(qū)采集不同品種(品系)顯癥的甘蔗樣品,以莖尖組培脫毒的健康植株葉片作為陰性對(duì)照。采用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒抽提葉組織總RNA,具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

    1.2 RT-PCR擴(kuò)增

    RT-PCR 擴(kuò)增引物根據(jù)文獻(xiàn)[9]合成,上游引物 SCMVF4 (5′-GTTTTYCACCAAGCTGGAACAGTC-3′;Y=C or T),下游引物 SCMVR3 (5′-AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC-3′),預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物約 700 bp。RT-PCR 用購(gòu)自寶(大連)生物工程有限公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒進(jìn)行,反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明,RT 體系:50μL 反應(yīng)體系中總 RNA 約 0.08μg/μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL、2×1 Step Buffer 25 μL、引物 SCMVF4 和 SCMVR3(20 μM)各 1 μL ,用 DEPC ddH2O 補(bǔ)足 50 μL。 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30min;95℃ 2 min;94℃ 1min,60℃ 1min,72℃ 1min,35 個(gè)循環(huán);72℃ 5min。 PCR 反應(yīng)結(jié)束后, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,在UVP凝膠成像系統(tǒng)中觀察檢測(cè)結(jié)果。對(duì)部分RT-PCR產(chǎn)物直接送測(cè)序和BLAST比對(duì),驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的正確性。

    1.3 感病品種(品系)調(diào)查

    2010年5—10月間先后從廣西甘蔗研究所、馱盧、憑祥、柳州、柳城、鹿寨、百色、貴港等甘蔗主產(chǎn)區(qū)采集不同品種(品系)顯癥甘蔗樣品進(jìn)行SCMV RT-PCR分子檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    以各地顯癥病葉組織總RNA抽提液為模板,經(jīng)引物對(duì)SCMVF4/SCMVR3進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果所檢測(cè)36份樣品中,其中25份顯陽(yáng)性(占69.4%),獲得預(yù)期大小(約700 bp)的DNA電泳條帶,健康和陰性對(duì)照樣品均無(wú)任何擴(kuò)增電泳(圖1),另外11份未檢出SCMV的顯癥樣品均可檢出SrMV(另文報(bào)道)。其中對(duì)8份擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序,結(jié)果有4份樣品獲得核苷酸數(shù)據(jù),另外有4份測(cè)序不成功(產(chǎn)物濃度低,測(cè)序信號(hào)出現(xiàn)雙峰或多峰)。所得序列在GenBank中比對(duì),結(jié)果與巴西和中國(guó)云南等地的多個(gè)SCMV分離物有96%~100%同源性,確認(rèn)它們均屬SCMV基因片斷序列。

    圖1 一步法RT-PCR檢測(cè)甘蔗植株葉片樣品中的SCMV

    在所調(diào)查的品種(品系)中,目前廣西主栽品種ROC22除在柳城蔗區(qū)未檢測(cè)到SCMV(檢測(cè)到SrMV,另文發(fā)表)外,其它蔗區(qū)均檢測(cè)到,ROC22最易受SCMV侵染;其它臺(tái)糖系列如臺(tái)糖16、臺(tái)糖28、臺(tái)糖95-889、臺(tái)優(yōu)均檢測(cè)到SCMV;柳城系列品種柳城03-182,柳城03-1137檢測(cè)結(jié)果也呈陽(yáng)性;廣西甘蔗研究所許多品系也都受到SCMV的感染(見(jiàn)表1)。

    表1 廣西蔗區(qū)SCMV調(diào)查結(jié)果

    3 討論

    本研究所調(diào)查的品種 (品系)中,目前主栽品種ROC22除在柳城蔗區(qū)未檢測(cè)到SCMV(檢測(cè)到SrMV,另文發(fā)表)外,在其他蔗區(qū)均檢測(cè)到SCMV,說(shuō)明ROC22最易受SCMV侵染。廣西蔗區(qū)比較嚴(yán)重的問(wèn)題是品種單一化,連年種植。據(jù)我們2010年調(diào)查,柳州地區(qū)甘蔗品種ROC22感花葉病比較嚴(yán)重,每一塊蔗田平均30%顯花葉癥,有的甚至達(dá)100%。應(yīng)該引起有關(guān)部門(mén)的重視,有效的防治方法是使用健康種苗或者替換品種,更換其它抗病品種。其它臺(tái)糖系列如臺(tái)糖16、臺(tái)糖28、臺(tái)糖95-889、臺(tái)優(yōu)均檢測(cè)到SCMV;柳城系列品種柳城03-182、柳城03-1137也易感染SCMV;廣西甘蔗研究所許多品系也檢測(cè)到SCMV。了解這些情況,對(duì)于育種工作者來(lái)說(shuō)尤為重要,為篩選親本培育抗病品種提供參考。

    許東林等對(duì)華南地區(qū)引種基地侵染甘蔗的SCMV遺傳多樣性進(jìn)行研究,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn),除廣東分離物SCMV-W31和海南分離物SCMV-N8外,其它分離物高度相近,聚集成一個(gè)獨(dú)立的簇[3]。我們廣西的SCMV遺傳多樣性如何,是否與上述結(jié)果相類(lèi)似,需要做進(jìn)一步研究分析。

    [1]蔣軍喜,周雪平,洪健.杭州地區(qū)甘蔗花葉病病原鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2002,10(4):377-380.

    [2]姚偉,段真珍,周會(huì),等.甘蔗花葉病毒福建分離物外殼蛋白基因的克隆及序列分析[J].植物病理學(xué)報(bào),2006,36(4):378-381.

    [3]許東林,周?chē)?guó)輝.侵染華南地區(qū)甘蔗的SCMV遺傳多樣性初探[J].植物病理學(xué)報(bào),2005,35(6):143-l44.

    [4]秦碧霞,蔡健和,劉志明,等.侵染廣西甘蔗的高粱花葉病毒分子鑒定初報(bào)[J].中國(guó)糖料,2007(4):29-31.

    [5]李文鳳,董家紅,丁銘,等.云南甘蔗花葉病病原檢測(cè)及一個(gè)分離物的分子鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào),2007,37(3):242-247.

    [6]蔣軍喜,謝艷,闕海勇.江西甘蔗花葉病病原的分子鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào),2009,39(2):203-206.

    [7]Grisham,M.P.,andPan,Y.-B.AgeneticshiftinthevirusstrainsthatcausemosaicinLouisianasugarcane[J].PlantDis,2007,91:453-458.

    [8]Perera,M.F.,F(xiàn)ilippone,M.P.,Ramallo,C.J.,Cuenya,M.I.,García,M.L.,Ploper,L.D.,and Castagnaro,A.P.Genetic diversity among viruses associated with sugarcane mosaic disease in Tucumán,Argentina[J].Phytopathology,2009,99:38-49.

    [9]O.M.Alegria,M.Royer,M.Bousalem,M.Chatenet,M.Peterschmitt,J-C.Girard,and P.Rott.Genetic diversity in the coat protein coding region of eighty-six sugarcane mosaic virus isolates from eight countries,particularly from Cameroon andCongo[J].Arch Virol,2003,148:357-372.

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