Mir-181 a通過靶向c-fos基因抑制肺癌細胞遷移

林述琨 溫吉海 王耀鵬

1.大連普蘭店市中心醫(yī)院病理科；2.普蘭店市中心醫(yī)院肺外科

MicroRNA(miRNAs)是一類在生物體內(nèi)普遍存在的單鏈非編碼蛋白質(zhì)小分子RNA，研究表明，它們可以特異性識別靶基因mRNA的3’UTR并與之結(jié)合，引起靶mRNAs發(fā)生降解或翻譯受到抑制[1,2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起癌基因或抑癌基因的作用[3,4]。Chen等[5]研究表明，miR-181a可以作用于凋亡相關(guān)Bcl-2蛋白，增加膠質(zhì)瘤細胞U87MG對放療的敏感性；同時也有研究表明，miR-181在EpCAM(+)AFP(+)的肝癌中的表達水平明顯的升高，且與預(yù)后不良相關(guān)[6]。MiR-181在肺癌中的研究目前尚未見報道。本研究通過transwell小室、生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報告基因等方法，探討miR-181a對肺癌細胞遷移的影響及其調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人肺腺癌細胞株A549，用含有10%新生牛血清，100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。當細胞生長至對數(shù)生長期后，按照lipo2000(Invitrogen公司)說明書的方法進行轉(zhuǎn)染。細胞轉(zhuǎn)染48h后提取細胞總RNA和蛋白進行后續(xù)相關(guān)實驗。

1.2 Real-time PCR 用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA(Takara)。miR-181a的反轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CTC ACC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′- GCC GAA ACA TTC AAC GCT CTC -3′，下游引物5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT -3′。以U6為內(nèi)參，反轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′-TGC GGG TGC TCC GCT TCG GCA GC-3′，下游引物5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。使用SYBR Green(Takara)染料法進行反應(yīng)，95℃預(yù)變性10min，95℃變性5s，60℃退火34s，74℃熒光檢測3s，共40個循環(huán)。以2–ΔΔCt值比較兩者之間的差異。每組重復(fù)設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3 雙熒光素酶報告基因檢測 應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件對 miR-181a 進行靶基因預(yù)測，選c-fos為候選靶基因，以基因組DNA為模版，擴增包括miR-181a 結(jié)合位點在內(nèi)的c-fos 3'UTR區(qū)，克隆到 pMir-Report報告基因載體的(Ambion公司)HindⅢ和 SpeI 酶切位點之間，重組載體命名為pMIR-c-fos。對pMIR-c-fos重組質(zhì)?！胺N子區(qū)”進行定點突變，突變后的質(zhì)粒命名為pMIR-c-fos-Mut。所有構(gòu)建的表達質(zhì)粒均經(jīng)雙酶切和測序鑒定。A549細胞在24 孔板中培養(yǎng)，細胞融合度為80 %左右時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分組為：miR-181a mimic+pMIR-c-fos組、miR-181a nc+pMIR-cfos、miR-181a mimic+pMIR-c-fos-Mut組和miR-181a nc+pMIR-c-fos-mut，每組設(shè)3 個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入裂解液(100μl/孔)，離心并收集上清至96孔板中，每孔中加入40μl螢火蟲熒光素酶底物，混勻10s 后檢測熒光強度；然后再加入40μl海腎熒光素酶底物，混勻 10 s 后檢測熒光強度。將螢火蟲熒光素強度值/海腎熒光素強度值進行標準化校正。

1.4 Western blot 檢測c-fos蛋白表達水平 用RIPA細胞裂解液(含有0.1% 的PMSF)冰上裂解細胞20min，收集于1.5mL EP 管中，離心后上清液轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白在SDS-PAGE中電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；5% 脫脂奶粉4℃過夜封閉，用c-fos的兔抗人單克隆一抗(1:1000)室溫下孵育2h(cell signal)，再用過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1:5000)室溫下孵育2h，以β-actin 為內(nèi)參，用Image J軟件分析蛋白條帶總灰度值，檢測表達差異。

1.5 Transwell小室檢測細胞遷移能力 將A549細胞培養(yǎng)于12孔板，在細胞融合度達80%時進行轉(zhuǎn)染。細胞轉(zhuǎn)染6h后更換為完全培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng)18h，然后用0.25% 的胰酶消化細胞，加入2ml完全培養(yǎng)液終止消化，離心后用Opti-MEM調(diào)整細胞密度為3×105個/mL的單細胞懸液。取100μl單細胞懸液移至上室內(nèi)，下室中加入600μl含10%新生牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16 h，每組設(shè)3個平行復(fù)孔。取出小室，移走上室內(nèi)的培養(yǎng)液，用滅菌的棉棒將上室內(nèi)的細胞輕輕刮掉，置于0.1%結(jié)晶紫染色液中染色30 min，取出小室，在蒸餾水中將其漂洗3次。倒置顯微鏡下觀察通過小室基膜的細胞并計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用t檢驗進行兩樣本間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Real-time檢測miR-181a表達 Real-time PCR檢測結(jié)果顯示miR-181a mimic 轉(zhuǎn)染組(mi)，與空白對照組(nc)相比，mi組中miR-181a的mRNA的表達量明顯增加(P<0.01，見圖1)，表明轉(zhuǎn)染miR-181a mimic后A549細胞中miR-181a表達明顯增加。

2.2 MiR-181a對A549細胞遷移能力的影響 Transwell小室檢測A549細胞在轉(zhuǎn)染miR-181a mimic后細胞遷移能力的改變，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181a mimic組(MI)穿膜細胞數(shù)為291.6±17.02個/視野，而空白對照組(NC)穿膜細胞數(shù)分別為191±13.1個/視野(見圖2)，轉(zhuǎn)染miR-181a mimic組與空白對照組相比，穿膜細胞數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明miR-181a能夠抑制A549細胞的遷移能力。

2.3 生物信息學(xué)預(yù)測c-fos是miR-181a的靶基因靶基因應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件 TargetScan對miR-181a的靶基因進行預(yù)測，分析顯示在c-fos的3'UTR 區(qū)有7 個堿基與c-fos的“種子區(qū)”完全互補配對(見圖3)，因此生物信息學(xué)預(yù)測認為c-fos可能是miR-181a的靶基因。

2.4 雙熒光素酶報告基因分析miR-181a對c-fos的調(diào)控作用 將miR-181a mimic和融合c-fos 3'UTR 的表達質(zhì)粒pMIR-c-fos共轉(zhuǎn)染A549 細胞后熒光素酶活性表達受到明顯的抑制，與轉(zhuǎn)染miR-181a nc和融合基因c-fos 3'UTR 的表達質(zhì)粒pMIR-c-fos組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-181a mimic和融合c-fos 3'UTR“種 子 區(qū) ”突 變 的 表 達 質(zhì) 粒pMIR-c-fos-Mut 共轉(zhuǎn)染A549細胞后熒光素酶活性沒有受到抑制，與對照組轉(zhuǎn)染空載體pCDNA3.1和融合基因c-fos 3'UTR 的表達質(zhì)粒的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖4)。結(jié)果表明，miR-181a能夠?qū)-fos 3'UTR 區(qū)起到抑制性的調(diào)控作用。

2.5 Western blot檢測miR-181a抑制c-fos蛋白表達miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組(mi)中c-fos蛋白表達與空白對照組(mock)和亂序轉(zhuǎn)染組(nc)中c-fos蛋白表達差異明顯，c-fos在miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組中表達明顯下調(diào)(見圖5)。結(jié)果表明，miR-181a能夠在翻譯水平上抑制c-fos蛋白表達。

3 討論

肺癌是對人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 早期研究表明在部分人類癌癥發(fā)病機制中MicroRNA(miRNA)的改變可能參與調(diào)控。miRNA可以與多種靶基因結(jié)合在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可起到癌基因或抑癌基因作用。本課題組前期通過芯片篩查肺癌組織和對應(yīng)的癌旁組織中差異表達的miRNAs時發(fā)現(xiàn)，miR-181a 在癌旁組織中表達明顯高于腫瘤組織。提示miR-181a可能作為抑癌基因參與肺癌的發(fā)生。

MiR-181a基因定位于人9號染色體上，成熟序列長為23 nt，是由92 nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體剪切、加工而成[7]。目前尚無miR-181a與肺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究報道。通常采用化學(xué)合成小分子的miRNAs 或 構(gòu) 建 miRNA表達載體進行miRNA功能研究[8,9]。本研究通過化學(xué)合成的miR-181a mimic進行后續(xù)實驗。

我們首先通過real-time PCR方法檢測了A549細胞轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-181a mimic后能夠高表達miR-181a，為正常表達水平的24.7倍。同時體外功能實驗表明miR-181a能夠抑制肺癌A549細胞的遷移。

為了探究miR-181a調(diào)控肺癌細胞遷移的分子機制，我們通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測c-fos可能是miR-181a的靶基因，通過雙熒光素酶報告基因證實了miR-181a對c-fos的3'UTR 區(qū)具有作用的基礎(chǔ)上，進一步在A549細胞中通過Western blot 方法證實了miR-181a 對c-fos的表達具有抑制作用。已有研究表明c-fos的表達與肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)[10,11]，我們認為miR-181a可能通過抑制c-fos表達調(diào)控肺癌細胞轉(zhuǎn)移。本研究為進一步探究miR-181a在肺癌中的作用提供了思路和治療的靶點。

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